Mechanizm Powstawania i Wzrostu Nowotworów Złośliwych* – dr Alexis Carrel

Nowy Jork w stanie Nowy Jork, Laboratoria Instytutu Badań Medycznych Rockefellera

Źródło: Mechanism Of The Formation And Growth Of Malignant Tumors*, Annals of Surgery 1925 Jul; 82(1): 1–13.
*Czytane przed Amerykańskim Stowarzyszeniem Chirurgów w dniu 5 maja 1925 roku.

Alexis Carrel (ur. 28 czerwca 1873 w Lyonie, zm. 5 listopada 1944 w Paryżu) – francuski chirurg i biolog. Laureat nagrody Nobla z fizjologii i medycyny w 1912 roku za opracowanie pionierskiej techniki szwu chirurgicznego naczyń krwionośnych. W 1906 roku dołączył do nowo utworzonego Instytut Badań Medycznych Rockefellera w Nowym Jorku, gdzie spędził resztę swojej kariery.

Mechanizm powstawania i wzrostu nowotworów złośliwych

Trudno oczekiwać, że uda nam się leczyć nowotwory złośliwe i przeciwdziałać ich występowaniu dopóki nie poznamy czynników determinujących ich powstawanie oraz warunków ich rozwoju. Do kwestii nowotworów należy podejść od strony fizjologicznej. Musimy ustalić jaki proces odpowiada za zdolność komórek do mnożenia się w nieskończoność w tkance nieaktywnej [uśpionej] dorosłego zwierzęcia. Rozwój nowotworów jest z całą pewnością zdeterminowany przez warunki tak określone, jak te, które rządzą wzrostem normalnych tkanek. To prawda, że komórki nowotworowe nie podlegają powszechnym prawom. Jednak ich anarchiczna postać wynika wyłącznie z naszego braku znajomości cech powodujących ich osobliwe zachowanie. Gdybyśmy znali wszystkie czynniki zdolne do wywołania proliferacji i odróżnicowania się komórek, zrozumielibyśmy genezę raka i na odwrót – ustalenie natury nowotworów złośliwych z pewnością zwiększyłoby naszą wiedzę na temat mechanizmów wzrostu tkanek. Zamiast jedynie poszukiwać wirusów, bakterii, helmintów lub substancji chemicznych, które mogą odpowiadać za występowanie nowotworów czy też badać zachowanie przeszczepionych fragmentów w organizmach zwierząt, musimy rozważyć fizjologiczne aspekty tego zagadnienia i naświetlić fundamentalne relacje łączące rozwój nowotworów, energię proliferacyjną zwykłych tkanek oraz funkcje płynów ustrojowych.

Mechanizmy, które powodują przejście tkanek w dorosłym organizmie w stan spoczynku i wznowienie ich aktywności podczas gojenia się rany bądź rozwoju nowotworu są niebywale złożone. Jednakże analiza eksperymentalna tych zjawisk jest od niedawna możliwa. Nowe mechanizmy umożliwiające wzrost fibroblastów, komórek nabłonkowych, leukocytów i komórek nowotworowych w czystych kulturach takich jak bakterie¹ rzuciły nieco światła na tę słabo znaną dziedzinę. Celem niniejszego artykułu jest jedynie zestawienie pewnych faktów, które zaobserwowałem badając tkanki zwykłe i nowotworowe, oraz omówienie ich znaczenia z obu perspektyw – powstawania guzów oraz ich wzrostu.

 

A. Mechanizm powstawania komórek nowotworowych

Nasza wiedza dotycząca warunków, w jakich dochodzi do transformacji zwykłych komórek w komórki nowotworowe jest bardzo niepełna. Jednakże nie ulega wątpliwości, że guzy prawie zawsze pojawiają się w miejscu przewlekłego podrażnienia – mięsaka występującego w młodym wieku i raka w starszym. Te proste obserwacje wskazują, że do powstania nowotworu konieczne są dwa czynniki – miejscowe podrażnienie i określony stan komórek oraz płynów ustrojowych, taki jak występuje w starszym wieku lub w młodości. Za powstawanie nowotworu nie odpowiada żaden konkretny czynnik. Ogromna ilość dowodów klinicznych oraz obserwacje Borrela, Fibiggera, Yamagiwy i innych udowodniły, że nowotwór rozwija się tak samo łatwo w centrum infekcji pasożytniczej lub bakteryjnej, jak w tkankach podrażnionych promieniami rentgenowskimi lub jakimiś substancjami chemicznymi. Jednak, aby rak mógł powstać, te czynniki drażniące wymagają określonej predyspozycji organizmu, takiej jak starzenie się w przypadku nowotworu złośliwego.

Naszym celem jest ustalenie w jaki sposób miejscowe podrażnienie determinuje nowotwór i jaki wpływ na to zjawisko może mieć ogólna kondycja organizmu. Badanie przeszczepionych guzów nie może dać nam żadnych informacji, jako że interesuje nas transformacja zwykłych komórek w komórki nowotworowe, nie zaś sposób ich reprodukcji. Na szczęście wraz z odkryciem przez Rousa mięsaka, który może być przenoszony przez swój przefiltrowany ekstrakt, uzyskaliśmy możliwość obserwacji guzów. Odkrycie to można uznać za najważniejszy krok naprzód w badaniach nad nowotworami w ciągu ostatnich dwudziestu pięciu lat, ponieważ umożliwiło bezpośrednią obserwację procesu powstawania guzów. Niedawno Yamagiwa także opracował skuteczną metodę produkcji tkanki nowotworowej z wykorzystaniem smoły pogazowej. Ten sposób powstawania nowotworów to powolny proces, podczas gdy przefiltrowany ekstrakt mięsaka Rousa cechuje się takim działaniem, że transformacja w warunkach in vitro zwykłej tkanki w mięsaka może nastąpić w ciągu dwóch dni.² Jednakże zarówno substancja Rousa, jak i smoła pogazowa zostały wykorzystane przeze mnie w dociekaniach na temat genezy komórek nowotworowych, roli podrażnienia w tym procesie, jak również mechanizmu oporu, jaki organizm stawia powstawaniu guzów.

Transformacja zwykłych komórek w komórki nowotworowe z wykorzystaniem czynnika Rousa 

Kiedy ekstrakt mięsaka Rousa, przefiltrowany przez filtr Berkefelda, zostanie wstrzyknięty kurze, powstaje złośliwy guz, który ogólnie rzecz biorąc zabija zwierzę na skutek przerzutów do płuc. Guz ten, jak dobrze wiadomo, ma postać mięsaka wrzecionowatokomórkowego, który jest dziś niesłychanie złośliwy i może doprowadzić do śmierci gospodarza w ciągu około dwóch tygodni. Kiedy ekstrakt mięsaka Rousa rozwija się w warunkach in vitro, komórki różnego typu migrują do pożywki hodowlanej. Są to w głównej mierze limfocyty polimorfonuklearne, makrofagi i fibroblasty. Musieliśmy określić czy wszystkie te komórki są złośliwe i czy cechy świadczące o złośliwości komórek należą do tylko jednego typu. Z mięsaka Rousa i innego mięsaka w organizmie kury wyizolowano czyste linie fibroblastów i dużych leukocytów mononuklearnych (monocytów, makrofagów krwi lub leukocytów endotelialnych), a po kilku tygodniach zbadano ich złośliwość wszczepiając je kurom. Ustalono, że fibroblasty nie są złośliwe³, podczas gdy czyste kultury makrofagów, po przeszczepieniu ich drobiowi, dały początek guzom, które błyskawicznie zabiły zwierzęta.⁴ Mimo że mięsak Rousa składa się z komórek wrzecionowatych, okazało się, że złośliwym elementem jest makrofag.

Wynik tych eksperymentów wskazywał, że wszczepienie substancji Rousa do organizmu prawdopodobnie przeobraża makrofagi tkankowe w komórki mięsakowe, wywierając niewielki lub żaden wpływ na fibroblasty. Założenie to zostało sprawdzone w warunkach in vitro. Czyste kultury fibroblastów i makrofagów krwi wszczepiono wraz z substancjami wywołującymi raka. Fibroblasty nie przekształciły się w komórki złośliwe⁵, a makrofagi tak.⁶ Ewidentnie okazało się, że makrofagi mają do substancji Rousa większe powinowactwo niż fibroblasty. Wydaje się zatem, że mięsak Rousa jest chorobą makrofagów. W niektórych eksperymentach Fischera⁷, w których serce embrionu nabrało cech mięsaka na skutek kontaktu z fragmentami guza Rousa, do kontaminacji doszło prawdopodobnie w wyniku infekcji makrofagów tkankowych czynnikiem Rousa. Kiedy wszczepi się w warunkach in vitro fragment mięsaka do tkanki serca, anormalna migracja mikrofagów tkankowych zaobserwowana przez Ebelinga⁸ pokazuje, że substancja Rousa w jakiś sposób wpłynęła na te komórki. Jednak nie jest wykluczone, że w pewnych okolicznościach fibroblasty mogłyby również ulec zakażeniu.

Możliwość transformacji czystej linii zwykłych monocytów w mięsaka została wykorzystana w badaniu dotyczącym podstawowych właściwości komórki złośliwej.⁹ Czyste kultury monocytów pobrane z krwi umieszczono w płaskich, okrągłych fiolkach, a następnie wszczepiono do nich niewielki przefiltrowany fragment mięsaka Rousa. Po kilku tygodniach wstrzyknięto je kurom i dały one początek błyskawicznie rosnącym guzom, które ostatecznie zabiły te ptaki na skutek przerzutów. Ewidentnie okazało się, że monocyty nabrały cech mięsaka. Zmiany, jakie przeszły wspomniane kultury można podsumować w następujący sposób:

Po wszczepieniu substancji Rousa do kultur monocytów, większość tych komórek mnoży się przez kolejne dni lub tygodnie. Jednak kilka makrofagów przyjmuje postać chorych komórek i niekiedy zlepia się w bryły. Komórki ameby wokół niewielkich mas tkanki bezpostaciowej wykazują mniejszą aktywność, wytwarza się w nich duża liczba wakuoli i ziarniny, przeobrażają się w fibroblasty^9,10,11 i w końcu umierają. Wydaje się, że substancja Rousa przekazuje monocytom chorobę, która wciąż pozwala komórkom replikować się, ale skraca ich życie.

Kiedy pożywkę hodowlaną zabarwi się czerwienią fenolową, staje się jasne, że tkanki zakażone czynnikiem Rousa wytwarzają więcej kwasów niż grupa kontrolne jeszcze nawet zanim nastąpią wyraźne zmiany morfologiczne.² Produkcja kwasów staje się bardziej widoczna, jeśli pożywka zawiera dużą ilość glukozy i jest pozbawiona powietrza. Pozostaje to w zgodzie z faktem odkrytym przez Warburga, że pozbawiona tlenu tkanka nowotworowa posiada wysoką zdolność glikolityczną. Produkcja kwasów przez komórki, jak również ich choroba, wyjaśniają wzrost przewodności elektrycznej komórek zaobserwowany przez Crile’a. Jak wykazał Osterhout, ta modyfikacja przewodności jest typowa dla uszkodzenia komórki, ale także dla wzrostu stężenia jonu H w tkankach. Trudno ją uznać za cechę charakterystyczną tylko i wyłącznie guzów nowotworowych.

Produkcja tkanki nekrotycznej oraz fermentacja pożywki wokół bezpostaciowych mas całkowicie modyfikują te kultury. Koagulat przyjmuje postać mapy geograficznej lub tkaniny pogryzionej przez mole. Produkowana jest duża liczba enzymów proteolitycznych, które później niszczą pożywkę i w końcu zabijają te kultury. Liczne monocyty przeobrażają się w duże komórki w kształcie trójkąta, wielokąta bądź wrzeciona, posiadające ostre wyrostki i wypełnione ziarniną. W znacznym stopniu przypominają zwykłe lub chore fibroblasty.

W tym procesie czynnik Rousa jest reprodukowany, czego dowodzi powstawanie złośliwych guzów nowotworowych po wszczepieniu kurom płynu powstałego z kultur.⁹

Z powyższych eksperymentów można wywnioskować, że zasadniczą cechą charakterystyczną mięsakowego makrofagu jest to, że jest chorą i żyjącą krótko komórką, która reprodukuje substancję odpowiedzialną za jej transformację w komórkę złośliwą. Komórka nowotworowa w żadnym wypadku nie jest anarchiczna ani też nie posiada tak wiele energii do wzrostu, ile zwykły monocyt. Jest to po prostu chora komórka. Przeobrażenie w komórkę złośliwą nie następuje na skutek długotrwałego procesu, jako że zaobserwowano, iż kultury zdrowej śledziony nabrały cech mięsaka w ciągu czterdziestu ośmiu godzin.²

Zmiany morfologiczne w czystych kulturach monocytów poddanych działaniu czynnika Rousa przypominają jeden z czystych obszarów, których rozwój w swoich kulturach pakietowca zaobserwował Twort po tym, jak wszczepił do nich czynnik lityczny, nazwany później przez d’Herelle’a bakteriofagiem. Na tych obszarach pakietowce zostały poddane lizie i zreprodukowały czynnik lityczny, przy czym proces ten mógł powtarzać się w nieskończoność. W analogiczny sposób, makrofagi z wszczepioną substancją Rousa chorują, reprodukują substancję Rusa i umierają. Dopóki w koagulacie znajdują się żywe komórki, substancja Rousa jest uwolniona w pożywce. Istnieje pewne podobieństwo między litycznym czynnikiem Tworta a czynnikiem Rousa. Co do obu można przypuszczać, że rozwijają się wewnątrz komórki pod wpływem zakłócenia metabolicznego wywołanego przez nieokreślony czynnik. Gdy tylko ten proces się rozpocznie, powiela się za pośrednictwem mechanizmu, którego nie rozumiemy, ale którego istnienie jest pewne.

Właściwości opisane przez nas jako charakteryzujące komórki złośliwe mięsaka Rousa są prawdopodobnie wspólne dla wszystkich komórek o cechach mięsaka. Przeprowadzono badanie zachowania w warunkach in vitro rozmaitych rodzajów nowotworów złośliwych², takich jak rakowiak jajników kur, inne mięsaki występujące u drobiu, rak szczurzy Flexnera-Joblinga, rak mysi, mięsak mysi, mięsak występujący u drobiu na skutek działania smoły pogazowej, potworniak występujący u drobiu, jak też ludzki mięsak wrzecionowatokomórkowy. W każdym przypadku komórki te były mniej aktywne niż zwykłe komórki tego samego typu i umierały przedwcześnie. Fermentacja pożywki przebiegała ogólnie w ten sam sposób, co w kulturach mięsaka Rousa. Mięsak występujący na skutek działania smoły pogazowej został poddany bardziej dogłębnemu badaniu.² Właściwości jego kultur w dużej mierze przypominają cechy mięsaka Rousa. Fragmenty błyskawicznie otaczają się leukocytami polimorfonuklearnymi i makrofagami. Komórki te są mniej oporne niż zwykłe leukocyty czy monocyty i duża ich liczba umiera w ciągu dwudziestu czterech godzin. Fermentacja pożywki przebiega w normalny sposób. Na sfermentowanym obszarze zauważyć można niewielkie bryłki materiału bezpostaciowego, umierających makrofagów i dużych fibroblastów mniej lub bardziej wypełnionych ziarniną i wakuolami. Po kilku dniach kultury przyjmują tę samą postać, co kultury mięsaka Rousa. Podsumowując: nie istnieje zasadnicza różnica między właściwościami kultur mięsaka Rousa a mięsaka występującego na skutek działania smoły pogazowej, przy czym większość właściwości makrofagów z obu guzów nowotworowych jest identyczna.

Nie rozumiemy jeszcze mechanizmu transformacji zwykłych komórek w komórki nowotworowe pod wpływem smoły pogazowej. Pomimo dużej liczby eksperymentów zainspirowanych odkryciem Yamagiwy, niewiele wiadomo ponad to, że smoła pogazowa wtarta w skórę lub wstrzyknięta do tkanek prowadzi do powstania nowotworu złośliwego.

Aby poddać to zjawisko bardziej dogłębnej analizie, Landsteiner i ja podjęliśmy próbę przekształcenia czystej linii fibroblastów w komórki o cechach mięsaka dodając do kultur niewielką ilość smoły pogazowej. Eksperymenty te trwały miesiącami. Zaobserwowano pewne zmiany morfologiczne, jednak żadna z kultur nie nabrała charakteru nowotworu złośliwego. W późniejszym czasie przeprowadziłem podobne eksperymenty z makrofagami, również uzyskując negatywne wyniki. Okazało się, że smoła pogazowa nie powoduje bezpośrednio przeobrażenia w warunkach in vitro zwykłych komórek w komórki nowotworowe i że sposób jej działania różni się radykalnie od sposobu działania substancji Rousa.²

W związku z tym założyłem, że smołę pogazową można uznać za prawdopodobnego prekursora substancji analogicznej do czynnika Rousa, który rozwija się w tkankach zwierzęcia pod wpływem dwóch czynników – podrażnienia miejscowego oraz modyfikacji osocza krwi wywołanej przez smołę pogazową. Hipotezy te zainspirowały poniższe eksperymenty. Pewnej liczbie kur, którym panna McFaul wstrzyknęła dożylnie roztwór smoły pogazowej, wszczepiono podskórnie niewielką ilość pulpy embrionalnej [embryonic pulp]³. Dało to początek potworniakom częściowo o charakterze mięsakowatym, których nawrót nastąpił po usunięciu narządu i które doprowadziły do powstania guza nowotworowego po przeszczepieniu innym kurom.

Wynik ten oznacza, że symultaniczne działanie obu czynników, pulpy embrionalnej [embryonic pulp]³ i stan płynów ustrojowych spowodowany dożylnym wstrzyknięciem smoły, mogą skutkować powstaniem nowotworu. Rak wywołany przez smołę byłby samonapędzającym się zakłóceniem metabolizmu wywołanym przez działanie substancji zawartej w płynach ustrojowych na komórki embrionalne i związanym bezpośrednio lub pośrednio ze smołą pogazową. Znajomość tego skutku daje możliwość uzyskania pewnej wiedzy o przyczynach powstawania innych guzów nowotworowych. Można sądzić, że określone substancje wytwarzane przez bakterie i helminty lub będące skutkiem poparzeń promieniami rentgenowskimi mogą determinować w makrofagach lub komórkach nabłonkowych, podobnie jak smoła pogazowa, zakłócenie, które w późniejszym czasie rozprzestrzenia się bez końca. Wykorzystując ten sam mechanizm, toksyczne substancje na ogół obecne we krwi w starszym wieku mogą wykazywać takie samo działanie na dzielące się komórki podrażnionego obszaru, jak surowica krwi kur, którym wstrzyknięto smołę na pulpę embrionalną [embryonic pulp]³. Ten prosty proces odpowiada za spontaniczną produkcję złośliwych guzów nowotworowych w organizmie.

Wpływ miejscowego podrażnienia na powstawanie mięsaka

 

Rak niemal zawsze rozpoczyna się w miejscu przewlekłego stanu zapalnego, o czym wie każdy chirurg. Jednak ten wpływ miejscowego podrażnienia na powstawanie nowotworu nie jest jeszcze dobrze znany. Rous zaobserwował, że miejscowe podrażnienie ułatwia powstawanie guzów nowotworowych pod wpływem ekstraktu mięsaka. Wychodząc z tych eksperymentów przeprowadziłem badanie mechanizmu tego zjawiska.²

Na początku ustaliłem, że na skutek tak niewielkiego stanu zapalnego, jaki wywołuje obecność małego kawałka wełnianej tkaniny w tkance podskórnej, substancja Rousa wytwarza guz nowotworowy w stężeniu tak niskim, jak 1 na 50.000, a następnie, że czynniki drażniące o zupełnie odmiennym charakterze zwiększają wpływ czynnika Rousa na tkanki. Jako że cechą wspólną tych czynników jest zdolność do wywoływania lekkiego stanu zapalnego, takie ich działanie spowodowane jest prawdopodobnie przez leukocyty, które przyciąga podrażniony obszar lub wydzielane przez nie substancje. Te dwa założenia zostały poddane próbie doświadczalnej.

Po wstrzyknięciu do wybranych kultur leukocytów, śledziony i serca embrionu tej samej ilości przefiltrowanego ekstraktu Rousa, transformacja w mięsaka nastąpiła szybciej w kulturach leukocytów i śledziony niż w kulturach serca. W innych eksperymentach kurom wstrzyknięto niewielką ilość miazgi tkanki embrionalnej [pulp of embryonic tissue]⁴ jednocześnie z czynnikiem Rousa. Guzy nowotworowe rozwinęły się znacznie wcześniej i były około pięć razy większe niż wytworzone przez samą tkankę mięsaka.²

Sprawdziliśmy ponadto czy w temperaturze ciała obecność substancji embrionalnych wydłuża czas działania czynnika Rousa w warunkach in vitro.² Powszechnie wiadomo, jako że Rous zbadał to zagadnienie, iż substancja wywołująca raka jest bardzo nietrwała i szybko traci aktywność w temperaturze ciała, gdy rozpuści się ją w roztworze soli fizjologicznej i w surowicy krwi. Jednakże w surowicy czynnik żyje nieco dłużej niż w soli fizjologicznej. Niedawno powtórzyłem te eksperymenty i uzyskałem potwierdzenie wczesnych wyników Rousa. W obecnych warunkach substancja Rousa rozpuszczona w roztworze Tyrode’a na ogół ginie w następstwie inkubacji trwającej piętnaście godzin, natomiast pozostaje aktywna po rozpuszczeniu w surowicy. Po dodaniu do surowicy świeżej tkanki i soku zarodkowego, czynnik może przetrwać kilka godzin dłużej, a w określonych warunkach nawet cztery dni.

Mechanizm miejscowego podrażnienia mający wpływ na powstawanie mięsaka z wykorzystaniem czynnika Rousa staje się teraz bardziej zrozumiały. Należy wyjaśnić w wyniku jakiego procesu bardzo niewielka ilość czynnika Rousa nie daje żadnego skutku po wstrzyknięciu do tkanek wyłącznie tego preparatu, ale decyduje o pojawieniu się guza nowotworowego, gdy tkanki są lekko podrażnione. Fiasko, jakim zakończyła się iniekcja do niepodrażnionych tkanek można przypisać nieobecności makrofagów i niepodatności dojrzałych fibroblastów na substancję Rousa. Jeżeli czynnik wywołujący mięsaka znajduje się w kontakcie jedynie z opornymi komórkami, spontanicznie traci swoją aktywność w krótkim czasie i nie dochodzi do powstania guzów. Ale jeśli w komórkach przyjmujących iniekcję panuje stan zapalny i znajdują się w nich leukocyty oraz ich soki, stają się bardziej podatne na czynnik Rousa. Jako że w tych warunkach substancja wywołująca mięsaka pozostaje aktywna przez dłuższy czas, ma większą szansę napotkania wrażliwych komórek, które następnie stają się złośliwe.

Mechanizm naturalnej oporności organizmu na powstawanie mięsaka

Kiedy myszy natrze się smołą pogazową lub drobiowi wszczepi się rozcieńczony czynnik Rusa, u niektórych osobników rozwija się nowotwór, u innych zaś nie. Oczywiste jest, że powstawanie guzów nowotworowych w wyniku działania konkretnego czynnika wymaga określonych predyspozycji lub braku oporności organizmu, którą można porównać z podatnością, jaką na rozwój nowotworów wykazują komórki osób w starszym wieku. Kilka lat temu Rous odkrył, że niektóre kury są odporne na wszczepienie przefiltrowanego ekstraktu mięsaka, inne zaś nie wykazują odporności. Ewidentne jest, że ta sama przyczyna nie wywołuje takiego samego skutku u każdego zwierzęcia. Niektóre osobniki są bardziej podatne niż inne na tworzenie się guza nowotworowego. Jako że zjawisko to jest bardzo istotne, podjąłem próbę wyjaśnienia jego mechanizmu.²

W pierwszej kolejności została opracowana metoda, za pomocą której można w przybliżeniu oszacować oporność zwierzęcia na czynnik Rousa. Wirulencja mięsaka Rousa wzrasta tak znacząco, że niewielka ilość ekstraktu wstrzyknięta dorosłej kurze zawsze determinuje pojawianie się guza. Wszystkie osobniki wydają się podatne na czysty ekstrakt. Różnice w ich oporności można zauważyć dopiero przy zastosowaniu rozcieńczonego ekstraktu. Najwyższe rozcieńczenie, które prowadzi do powstania nowotworu, można przyjąć jako miarę podatności zwierzęcia. Dużej grupie kur wszczepiono podskórnie małe krążki flanelowe nasączone roztworami ekstraktu mięsaka Rousa, różniące się stężeniem od 1:1.000 do 1:50.000, przy czym najwyższe rozcieńczenie prowadzące do powstania nowotworu zostało przyjęte za wskaźnik podatności.  U niektórych zwierząt wszystkie roztwory, nawet ten o najwyższym rozcieńczeniu, spowodowały powstanie mięsaka. U innych nie zaobserwowano żadnych guzów lub też pojawiły się one jedynie przy konkretnych rozcieńczeniach. Zwierzęta podzielono na kilka grup według stężenia czynnika Rousa, który doprowadził do powstania nowotworu i do pewnego stopnia określono ich podatność bądź oporność.²

Poziom oporności pojedynczego osobnika na mięsaka Rousa wydaje się stałą cechą. Kilka kur, które wykazały odporność na pierwsze wszczepienie, poddano ponownej iniekcji trzy- lub czterokrotnie w ciągu roku i pozostały odporne. Inne kury okazały się wrażliwe i rozwinęły się u nich guzy nowotworowe, które szybko usunięto, aby zapobiec wystąpieniu przerzutów. Niektóre z tych zwierząt przeżyły i po kilku miesiącach zostały poddane kolejnej transplantacji. Okazały się tak podatne, jak po pierwszym wszczepieniu. Jedną z głównych przyczyn podatności na działanie substancji Rousa był wiek. Młode zwierzęta są zawsze mniej oporne niż stare lub dotknięte jakąkolwiek wyniszczającą chorobą.²

Ponieważ kilka ewidentnie zdrowych kur nie poddaje się wpływowi substancji Rousa, z całą pewnością istnieje jakiś mechanizm, który chroni odporne lub względnie odporne zwierzę przed działaniem czynnika zakaźnego. Można przypuszczać, że u mniej podatnych zwierząt czynnik Rousa traci swoją aktywność na skutek działania płynów ustrojowych zanim uzyska możliwość zainfekowania tkanek albo że makrofagi mają do czynnika Rousa mniejsze powinowactwo niż makrofagi podatnych zwierząt lub też że nie występują w wystarczającej ilości. Pierwszą z tych hipotez zweryfikowano badając w warunkach in vitro wpływ surowicy krwi odpornych i podatnych zwierząt na czynnik Rousa. Łącząc surowicę dużej liczby zwierząt podatnych lub odpornych na mięsaka z niewielką ilością czynnika Rousa, inkubując ją przez kilka godzin i wszczepiając drobiowi nasączone tym płynem krążki flanelowe, udało się sprawdzić czy czynnik utracił aktywność pod wpływem działania surowicy. Ogólnie rzecz biorąc czynnik szybciej stracił zdolność do wytwarzania guzów nowotworowych w surowicy odpornych zwierząt niż w surowicy zwierząt podatnych. W warunkach prowadzonych przeze mnie eksperymentów substancja Rousa, inkubowana uprzednio roztworem Tyrode’a oraz surowicą perliczki, kaczki lub królika zazwyczaj nie prowadziła do powstania guzów. Kiedy inkubowano ją surowicą podatnego drobiu/kur, dawała początek mięsakowi. Mieszanina czynnika Rousa i surowicy odpornych zwierząt na ogół nie prowadziła do powstania nowotworu lub powodowała go po dłuższym czasie. Wydaje się zatem, że surowica podatnych zwierząt różni się znacząco od surowicy zwierząt niepodatnych pod tym względem, że stanowi lepszą pożywkę dla czynnika Rousa. Aby nieco lepiej zrozumieć to zjawisko, zbadałem wpływ pewnych modyfikacji zwykłej surowicy na konserwację czynnika Rousa. Kiedy surowicę podgrzano do temperatury 70°C, jej zdolność do hamowania spontanicznego niszczenia substancji Rousa została praktycznie utracona. Ustalono, że surowica młodego drobiu jest zwykle lepszą pożywką niż surowica starych osobników. Istnieje prawdopodobnie pewien związek między powinowactwem czynnika Rousa do makrofagów i komórek embrionalnych a jego długotrwałą aktywnością w młodej surowicy.

Indywidualna podatność jest częściowo zdeterminowana przez określony stan płynów ustrojowych, który zależy od wieku zwierzęcia, jego metabolizmu, stanu zdrowia, być może diety, a także wielu innych czynników, zwłaszcza dziedziczenia. Z całą pewnością istnieją inne przyczyny tego zjawiska, ale jak dotąd nie wiemy dokładnie jakie. Ogólny stan organizmu, który modyfikuje jego oporność na mięsaka, ma wielkie znaczenie praktyczne. Nie jest wykluczone, że dogłębna znajomość mechanizmu wywołującego odporność może ostatecznie doprowadzić do opracowania metod zmniejszania częstotliwości występowania nowotworów złośliwych.

B. Mechanizm wzrostu guzów nowotworowych

Czynniki determinujące transformację zwykłych komórek w komórki złośliwe i czynniki, które powodują niekończący się wzrost guza nowotworowego w organizmie nie są identyczne. Aby zrozumieć przebieg rozwoju mięsaka w organizmie dorosłego zwierzęcia, należy dowiedzieć się jakie czynniki zapobiegają wzrostowi zdrowych tkanek.

Regulacja wzrostu zdrowych tkanek. 

Naukowcy powszechnie zakładali, że wzrost tkanki zostaje zatrzymany z chwilą wyczerpania się energii uzyskiwanej z komórki jajowej. Teorię tę obalono przeprowadzając badanie regulacji rozmnażania się komórek w warunkach in vitro, które ujawniło następujące dwa fakty: można sprawić, że fragmenty tkanki łącznej pobrane od dorosłego zwierzęcia będą namnażać się tak samo aktywnie, jak tkanki embrionalne^12,2 oraz linia fibroblastów w czternastym roku życia w warunkach in vitro wykazuje tę samą aktywność proliferacyjną, co tkanka embrionalna.¹³ Zatem oczywiste jest, że energia do wzrostu dojrzałej tkanki łącznej nie zostaje wyczerpana i że energia do wzrostu tkanki embrionalnej jest nieograniczona w pewnych okolicznościach. Inna klasyczna teoria wyjaśnia zahamowanie wzrostu dorosłej tkanki pod wpływem naporu ze strony innych tkanek. Założenie to również poddano próbie eksperymentalnej. Po usunięciu fragmentów tkanek łącznych lub nabłonkowych z organizmu dorosłego zwierzęcia i wyhodowaniu ich w surowicy krwi, komórki rozmnażają się przez chwilę, jednak ich masa się nie zwiększa.¹⁴ Brak nacisku ze strony otaczających je tkanek nie daje komórkom zdolności do syntetyzowania nowej protoplazmy z surowicy.

Brak aktywności dojrzałych komórek należy wiązać z inną przyczyną. Gdy tylko wykorzystanie czystych kultur fibroblastów umożliwiło analizę warunków decydujących o wzroście, odkryłem, że liczba fibroblastów wytworzonych w warunkach in vitro w danym czasie zależy od składu pożywki. W surowicy krwi pochodzącej od dorosłego zwierzęcia mnożenie się fibroblastów jest wolniejsze i ostatecznie ustaje. Kiedy do pożywki doda się sok tkanki embrionalnej, wskaźnik wzrostu stopniowo się zwiększa do momentu, gdy fragmenty tkanki podwajają swoją objętość co czterdzieści osiem godzin. Innymi słowy, energia do wzrostu czystej kultury komórkowej stanowi funkcję stężenia zawartych w pożywce substancji wspomagających wzrost i hamujących go.^12,14,15

Substancje wspomagające wzrost znajdują się głównie w sokach żołądkowych, a ich zasadniczą właściwością jest zdolność do ożywiania dojrzałej tkanki łącznej i nabłonka oraz pobudzania proliferacji obu tkanek.¹⁶ Można je łatwo zniszczyć przez podgrzewanie, nie przechodzą przez filtr Chamberlanda i szybko tracą aktywność w temperaturze ciała. Są analogiczne do substancji obecnych w leukocytach, złośliwych guzach nowotworowych i w pewnych dojrzałych tkankach. Różnią się od hormonów, ponieważ nie ograniczają się jedynie do stymulowania wzrostu, ale także zawierają materiał pokarmowy niezbędny w procesie syntezy protoplazmy. Soki tkanki embrionalnej mają zdolność do utrzymywania fibroblastów i komórek nabłonkowych w rzeczywistym stanie hodowli i decydują o nieograniczonym wzroście ich objętości.¹⁴

Surowica krwi, w której komórki mogą rozmnażać się przez jakiś czas, nie zapewnia fibroblastów i komórek nabłonkowych z materiałem odżywczym koniecznym do budowy nowych tkanek.^14,18 Nie stanowi ona pożywki bakteryjnej dla tych komórek. Ponadto surowica wykazuje działanie hamujące proliferację komórek.¹⁹ Jej zdolność do hamowania wzrostu, nieznaczna w młodości, zwiększa się stopniowo w ciągu całego życia i staje się bardzo silna w starszym wieku.²⁰ Ta istotna właściwość surowicy jest efektem antagonistycznego działania dwóch grup substancji – globuliny wykazującej niewielką zdolność do wspomagania wzrostu oraz połączenia albuminy i innych substancji, które jest stabilne, odporne na podgrzewanie i posiada silne właściwości hamujące rozmnażanie komórek.²¹

Należało sprawdzić czy osocze krwi i limfa śródmiąższowa charakteryzują się tym samym hamującym działaniem, co surowica. Wzrost kultur fibroblastów, które przez lata rozmnażały się aktywnie w warunkach in vitro, ustaje po kilku dniach od wszczepienia ich drobiowi.¹ Wstrzyknięcie pulpy embrionalnej kurczaka dorosłej kurze prowadzi zazwyczaj do powstania potworniaka, którego wzrost ustaje po kilku tygodniach i który uzyskuje energię do wzrostu tak nieznaczną, jaką posiadają tkanki gospodarza.² Płyny ustrojowe w dorosłym organizmie, zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro, wydają się hamować proliferację komórek. Inny dowód podobnych hamujących właściwości surowicy i osocza krwi stanowią analogiczne zmiany tempa gojenia się ran w zależności od wieku, a także uniemożliwiającego wzrost działania surowicy.²² Można z całą pewnością uznać, że powstrzymujące wzrost właściwości osocza nie różnią się znacząco od właściwości surowicy.

Wydaje się, że przed jakimkolwiek anormalnym wzrostem tkanek chroni organizm potrójny mechanizm, na który składają się brak w surowicy materiału odżywczego niezbędnego fibroblastom i określonym komórkom nabłonkowym do syntezy protoplazmy, hamujące wzrost działania surowicy oraz niestabilność substancji wspomagających wzrost, które mogą zostać uwolnione do płynów ustrojowych. Podczas gdy zawarte w surowicy substancje hamujące są bardzo trwałe, nie rozpadają się spontanicznie w temperaturze ciała i regenerują się w krótkim czasie, substancje wspomagające rozmnażanie komórek są przechowywane w komórkach, a jeśli zostaną uwolnione do płynów ustrojowych, szybko tracą swoją aktywność w temperaturze ciała. Nie ulega wątpliwości, że organizm  jest dobrze chroniony przed proliferacją komórek. Znajomość tego mechanizmu sprawia, że wzrost złośliwych guzów nowotworowych zachodzący w organizmie dorosłego zwierzęcia pomimo hamującego działania płynów ustrojowych i niedostatecznej ilości substancji wspomagających wzrost wydaje się jeszcze bardziej paradoksalny.

Należy wyjaśnić w jaki sposób komórki mogą rozmnażać się w wykazujących hamujące działanie płynach ustrojowych. Nawet w okresie starzenia się nieaktywne komórki wznawiają swoje działanie o ile jest to konieczne. Rany goją się, a guzy nowotworowe rosną równie łatwo u osób starszych, jak u młodych, zaś jedyna różnica polega na tym, że tempo gojenia się i wzrostu guzów spowalnia się, gdy pacjent jest w podeszłym wieku. Zjawisko to można przypisać obecności w dorosłym i starym organizmie substancji wspomagających wzrost, które są przechowywane w komórkach nabłonkowych i leukocytach i mogą zostać uwolnione do płynów ustrojowych.^23,24 Kiedy w procesie regeneracji tkanki muszą wznowić aktywność wspomagającą wzrost, hamujące działanie surowicy zostaje zrównoważone przez substancje pochodzące z komórek nabłonkowych oraz leukocyty. Te drugie można uznać za ruchome gruczoły jednokomórkowe, które dostarczają stałym komórkom materiał odżywczy konieczny do ich rozmnażania.^17,24  Komórki nabłonkowe również zawierają substancje odżywcze. W procesie zabliźniania się ran, materiał odżywczy niezbędny do powstawania nowych komórek może pochodzić z leukocytów²⁴ i z samych komórek nabłonkowych.

Regulacja wzrostu mięsaka

Prawdopodobne jest, że mięsak wrzecionowatokomórkowy rośnie w dorosłym organizmie z tych samych przyczyn, dla których rana się zabliźnia lub w narządzie wewnętrznym panuje przewlekły stan zapalny bądź też ulega on stwardnieniu. Hipotezy, według której komórki nowotworowe są anarchiczne nie da się obronić. Istnieją bezpośrednie dowody eksperymentalne, że komórki mięsaka hodowane w warunkach in vitro posiadają te same właściwości hodowlane, co zwykłe komórki, ale są chore i przedwcześnie umierają. Nieograniczony wzrost mięsaka w warunkach in vivo wydaje się paradoksalny, gdy weźmie się pod uwagę, że w warunkach in vitro jego energia do wzrostu jest bardzo słaba. Jednak zjawisko to można łatwo wyjaśnić, gdyż odpowiadają za nie cechy uznawane za charakterystyczne dla komórek złośliwych. Te komórki to makrofagi, które mogą się z łatwością rozmnażać w surowicy organizmów dorosłych. Zawierają substancje analogiczne do trefonów zarodkowych^17,25 i sprzyjają rozmnażaniu komórek. Poza tym atakują i niszczą struktury anatomiczne takie jak mięśnie, które rosnące tkanki mogą wykorzystać jako materiał odżywczy. Choroba, która przekształca zwykłe komórki w złośliwe charakteryzuje się działaniem samonapędzającym oraz powolną destrukcją komórek. Jednym z jej skutków jest nagromadzenie na pewnym etapie chorych komórek, które służą jako magazyny substancji wspomagających wzrost. Oczywiste jest, że jeśli substancje dzięki którym komórki się rozmnażają są stale uwalniane na ograniczonym obszarze w organizmie, rozwija się guz nowotworowy. Zjawisko to może tłumaczyć multiplikację fibroblastów i innych komórek w przypadku mięsaka Rousa oraz mięsaka spowodowanego działaniem smoły pogazowej, jak również anormalną energię do wzrostu tkanki chrzęstnej, kości i nabłonka, którą zaobserwowaliśmy w odniesieniu do eksperymentalnych potworniaków po tym, jak zostały częściowo przeobrażone w mięsaki.² Ewidentnie rozwój guza nowotworowego w nieaktywnych tkankach starego zwierzęcia nie wyraża tendencji do anarchicznego wzrostu grupy komórek, lecz spowodowany jest po części przez czynniki analogiczne do tych, które cechują zwykłą regenerację tkanek.

Powszechnie wiadomo, że tempo wzrostu guza konkretnego rodzaju zależy od pewnych uwarunkowań pacjentów, w szczególności od ich wieku. Rozwój nowotworu przebiega szybko u młodych pacjentów, a wolno u chorych w starszym wieku. Jednak rak należący do tego samego typu histologicznego rozwija się w bardzo zróżnicowanym tempie u osób w identycznym wieku. Jest oczywiste, że tempo wzrostu guzów nowotworowych warunkuje wiele innych czynników niż tylko wiek. Odwrotnie ma się sprawa ze zmianami tempa regeneracji tkanek w sterylnej ranie, które zależą wyłącznie od wieku pacjenta. Związek między wiekiem a tempem gojenia się ran u osób zdrowych jest tak niezmienny, że znając wielkość rany oraz tempo gojenia się można za pomocą równania du Noüy’ego obliczyć wiek danej osoby.²⁶  Zjawisko to wynika z faktu, że w przypadku sterylnych ran żaden inny czynnik poza składem limfy śródmiąższowej nie może znacząco zmienić energii do wzrostu regenerujących się tkanek. Jednak gdy rana ulegnie zakażeniu, tempa gojenia się nie reguluje już wyłącznie wiek pacjenta, lecz substancje uwalniane przez bakterie, ropę oraz martwą tkankę. Staje się ono bardzo nieregularne²⁷, zaś krzywej zabliźniania nie można już wyrazić stosując wzór du Noüy’ego. W tych nowych okolicznościach energii do wzrostu regenerujących się komórek nie reguluje normalna limfa, ale zależy ona od wielu skomplikowanych czynników. Prawdopodobne jest, że substancje uwalniane przez mniej lub bardziej chore tkanki oraz zmiany hamującego działania osocza krwi wpływają w ten sam sposób na energię do wzrostu komórek nowotworowych. Odkryłem, że płyn śródmiąższowy z mięsaka kury wykazuje zróżnicowany, niejednokrotnie sprzeczny wpływ na rozmnażanie zwykłych tkanek. W zależności od natury i stanu tkanek może wspomagać wzrost fibroblastów lub przeciwnie, być dla nich toksyczny.²  Obecność substancji pochodzących ze zwykłych i chorych komórek oraz produktów ich rozpadu modyfikuje tempo wzrostu samego nowotworu, podobnie jak zwykłych tkanek.

Tempo wzrostu mięsaka, tak jak gojenia się ran, regulują określone uwarunkowania osocza krwi, które nie zależą od wieku. Surowica osób chorych na kacheksję i ogólną infekcję organizmu zawiera pewne substancje, które potęgują jej działanie hamujące wzrost. Kiedy w organizmie pacjenta ze sterylną raną rozwija się ropień, proces zabliźniania się rany staje się bardzo powolny i może całkowicie ustać.²⁸ To samo zjawisko obserwuje się u pacjentów z kacheksją. Kiedy warunki te zostaną odtworzone w organizmach zwierząt, surowica zaczyna wykazywać silniejsze działanie hamujące wzrost fibroblastów.²⁹ Podobne zjawiska obserwuje się w związku ze wzrostem mięsaka. Tempo wzrostu mięsaków znacząco się zmniejsza, kiedy zwierzę jest chore lub zagłodzone i ustaje całkowicie w przypadku skrajnej kacheksji.² Innymi słowy istnieje wyraźny związek między uwarunkowaniami regulującymi wzrost mięsaka a tempem wzrostu zwykłych tkanek.

Powyższy opis mechanizmu powstawania i wzrostu guzów nowotworowych nie jest w żadnym sensie pomyślany jako precyzyjne ujęcie tych złożonych zjawisk. Nie należy też uznawać mojego obecnego pojmowania tego procesu za ostateczne. Zestawienie na pozór niepowiązanych ze sobą faktów służy jedynie jako przydatny zabieg umożliwiający zrozumienie ich znaczenia. Nowe zjawiska nie są interesujące z naukowego punktu widzenia, jeśli nie połączy się ich z tym, co już wiadomo i jeżeli nie przecierają szlaku dla przyszłych odkryć. Interpretacja faktów, do jakiej doprowadziły mnie wyniki prowadzonych przeze mnie badań, z całą pewnością ulegnie modyfikacji. Robocze hipotezy mają krótki żywot. Ich celem nie jest ścisła interpretacja mechanizmów stojących za złożonością zjawiska, ale zainspirowanie do badań, które zbliżą nas do prawdy.

 

Przypisy:

1 Carrel, A. : Tissue Culture and Cell Physiology. Physiol. Reviews, 1924, vol. iv, p. 1. Carrel, A. : The Method of Tissue Culture : Its Bearing on Pathological Problems. Brit. Med. J., 1924, vol. ii, p. 140.
2 Carrel, A.: Unpublished Experiments.
3 Carrel, A. : Cultures Pures de Fibroblastes Provenant de Sarcomes Fusocellulaires. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xc, p. 1380.
4 Carrel, A. : La Malignité des Cultures Pures de Monocytes du Sarcome de Rous. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xci, p. 1067.
5 Carrel, A. : Effet de l’Extrait de Sarcomes Fusocellulaires sur des Cultures Pures de Fibroblastes. Compt. rend. Soc. de biol., 1925, vol. xcii, p. 477.
6 Carrel, A. : Action de l’Extrait du Sarcome de Rous sur les Macrophages du Sang. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xci, p. 1069.
7 Fischer, A. : En Metode til Dyrkning af Ondartede Svulstceller Ubegraenset udenfor Organismen. Hospitalstidende, 1924, vol. lxvii, p. 169.
8 Ebeling, A. H. : Unpublished Experiments.
9 Carrel, A. : Essential Characteristics of a Malignant Cell. J. Am. Med. Assoc., 1925, vol. lxxxiv, p. 157.
10 Carrel, A : Comparison des Macrophages Normaux et des Macrophages Transformés
en Cellules Malignes. Compt. rend. Soc. de biol., 1925, vol. xcii, p. 584.
11 Fischer, A. : Cellules Sarcomateuses et Macrophages. Compt. rend. Soc. de biol., 1925, vol. xcii, p. 392.
12 Carrel, A. : Contributions to the Study of the Mechanism of the Growth of Connective
Tissue. J. Exp. Med., 1913, vol. xviii, p. 287.
13 Carrel, A., and Ebeling, A. H. Unpublished Experiments. Ebeling, A. H. : A Ten Year Old Strain of Fibroblasts. J. Exp. Med., 1922, vol. xxxv, P- 755¬12
14 Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Survival and Growth of Fibroblasts in Vitro. J. Exp.
Med., 1923, vol. xxxviii, p. 487.
15 Carrel, A. : Measurement of the Inherent Growth Energy of Tissues. J. Exp. Med., 1923, vol. xxxviii, p. 521. Carrel, A. : Énergie Intrinsèque et Énergie Résiduelle des Tissus. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xc, p. 66.
16 Carrel, A. : Artificial Activation of the Growth in Vitro of Connective Tissue. J. Exp Med., 1913, vol. xvii, p. 14. Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Action on Fibroblasts of Extracts of Homologous and Heterologous Tissues. J. Exp. Med., 1923, vol. xxxviii, p. 499.
17 Carrel, A. : Leucocytic Trephones. J. Am. Med. Assoc., 1924, vol. lxxxii, p. 255.
18 Carrel, A., and Ebeling, A. H.: The Multiplication of Fibroblasts in Vitro. J. Exp. Med., 1921, vol. xxxiv, p. 317.
Carrel, A., and Ebeling, A. H.: Action of Serum on Fibroblasts in Vitro. J. Exp. Med.,
1923, vol. xxxvii, p. 759.
Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Action of Serum on Lymphocytes in Vitro. J. Exp. Med., 1923, vol. xxxviii, p. 513.
19 Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Age and Multiplication of Fibroblasts. J. Exp. Med., 1921, vol. xxxiv, p. 599. Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Heterogenic Serum, Age, and Multiplication of Fibroblasts. J. Exp. Med., 1922, vol. xxxv, p. 17.
Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Antagonistic Growth-Activating and Growth-Inhibiting Principles in Serum. J. Exp. Med., 1923, vol. xxxvii, p. 653.
20 Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Antagonistic Growth Principles of Serum and Their Relation to Old Age. J. Exp. Med., 1923, vol. xxxviii, p. 419.
21 Carrel, A., et Ebeling, A. H. : Mécanisme de l’Action du Serum sur les Fibroblastes Pendant la Vieillesse. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xc, p. 172.
Carrel, A. : Diminution Artificielle de la Concentration des Protéines du Plasma Pendant la Vieillesse. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xc, p. 1005.
22 Carrel, A.: Tissue Culture and Cell Physiology. Physiol. Reviews, 1924, vol. iv, p. 1.
23 Carrel, A. : Growth-promoting Function of Leucocytes. J. Exp. Med., 1922, vol. xxxvi, p. 385.
24 Renaut, J.: Traité d’Histologie Pratique, Paris, 1893, vol. i, pt. 2, p. 968.
Jolly, J. : Le Tissu Lymphoïde Considéré Comme un Tissu de Réserve. Compt. rend. Soc. de biol., 1920, vol. xxxvi, p. 1209.
Cramer, W., Drew, A. H., and Mottram, J. C. : On the Function of the Lymphocyte and of Lymphoid Tissue in Nutrition. Lancet, 1921, vol. ii, p. 1202.
Cramer, A. : Vitamins in Health and Disease. Lancet, 1924, vol. i, p. 633.
Carrel, A. : Cicatrization of Wounds. XII. Factors Initiating Regeneration. J. Exp. Med., 1921, vol. xxxiv, p. 425. Carrel, A., and Ebeling, A. H. : Leucocytic Secretions, J. Exp. Med., 1922, vol. xxxvi, P- 645.
25 Carrel, A., et Ebeling, A. H. : Tréphones Embryonnaires. Compt. rend. Soc. de biol.,
1923, vol. lxxxix, p. 1142.
26 du Noiiy, P. L. : Mathematical Expression of the Curve Representing Cicatrization. J. Exp. Med., 1916, vol. xxiv, p. 451.
du Noiiy, P. L. : The Relation Between the Age of the Patient, the Area of the Wound, and the Index of Cicatrization. J. Exp. Med., 1916, vol. xxiv, p. 461.
27 Carrel, A., and Hartmann, A. : Cicatrization of Wounds. I. The Relation Between the Size of a Wound and the Rate of its Cicatrization. J. Exp. Med., 1916, vol. xxiv, p. 429.
28 Carrel, A. : Effet d’un Abcès à Distance sur la Cicatrisation d’une Plaie Aseptique. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xc, p. 333.
29 Carrel, A., et Ebeling, A. H. : Indice de Croissance du Serum Sanguin. Compt. rend. Soc. de biol., 1924, vol. xc, p. 170.

 

Zobacz na: Dlaczego trucie jest opłacalne – Uzasadnienie trucia przemysłowego – Jim West
Prawda o raku – epizod 1 – Prawdziwa historia chemioterapii & Farmaceutyczny monopol
Wirus ludzkich brodawczaków (HPV) a rak szyjki macicy
Dieta przeciwzapalna, flora jelitowa – mikrobiom – dr Art Ayers
Szczepionki i zapalenie mózgu – dr Harold E. Buttram i Catherine J. Frompovich

 

“Schulz (1888) mógł być pierwszym, który zaobserwował stymulację wywołaną truciznami o bardzo niskich stężeniach. Zbadał wpływ chlorku rtęci, jodu, bromu, kwasu arsenowego, kwasu chromowego, kwasu mrówkowego i kwasu salicylowego na drożdżach. Doszedł do wniosku, że po wystarczającym rozcieńczeniu wszystkie z nich mogą zwiększyć żywotność drożdży w dłuższym lub krótszym okresie czasu. Kilka lat później bakteriolog Ferdinand Hueppe(1896 r.) określił zasadę, która została nazwana jego nazwiskiem.
„Każda substancja, która zabija i niszczy protoplazmę w pewnych stężeniach, hamuje rozwój w niższych stężeniach, ale działa jak bodziec/stymulator i zwiększa potencjał życiowy w jeszcze niższych stężeniach poza punktem neutralności.”
Ustalając tę zasadę Hueppe wspomniał o pewnych oczywistych wyjątkach. Potwierdził także niezależne odkrycie tej reguły przez Arndla i Schulza.” – Beneficial Effects of Small Dosages, Hayes’ Handbook of Pesticide Toxicology, Volume 1