Izolacja wirusa polio: Brak dowodów

Mikrobiolog dr Howard Urnovitz, zwrócił moją uwagę na badanie dotyczące izolowania wirusa polio podczas spotkania w biurze Nicholasa Regush w siedzibie ABC. Spotkanie odbyło się w kwietniu 2001. Artykuł ten został opublikowany rok po publikacji mojego o DDT i polio w Townsend Letters w 2000 roku. – Jim West

Czy program eradykacji wirusa polio uwolni świat od porażenia dziecięcego? –  Neenyah Ostrom

Neenyah Ostrom

Neenyah Ostrom

20 kwiecień 2001

Co jest przyczyną tak dużej zapadalności na ostre porażenie wiotkie (AFP -Acute Flaccid Paralysis), gdy jednocześnie jest tak mała wykrywalność wirusa polio na świecie?

Każde dziecko dorastające we wczesnych latach 50 – tych XX wieku z pewnością pamięta panikę jaka ogarnęła kraj, niezmiennie przydarzająca się w najgorętsze dni lata, zamykane baseny publiczne i wizyty u lekarzy z powodu oznak sztywności karku lub wiotczenia nogi. W głębi mojej pamięci wciąż tkwi strach wzbudzany przez wymawiane szeptem słowo „polio”, niezbyt odległy od tego co pamiętam z czasów ery Zimnej Wojny, z ćwiczeń szkolnych typu krycie się pod stołem w bezpiecznej pozycji, regularnie odbywających się w szkole średniej.

Z perspektywy czasu wydaje się to śmieszne, że kiedykolwiek wierzyliśmy w to, że stoliki wykonane ze sklejki i zakrycie głowy rękami mogłoby ochronić dzieci w szkole przed nuklearnym atakiem. Nasz nie całkiem racjonalny lęk przed wirusem polio wciąż trwa pomimo programów eradykacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), wdrażanych w różnych zakątkach rozwijających się krajów. Jednym z powodów tej długotrwałej obawy jest wciąż utrzymująca się częstość występowania ostrego porażenia wiotkiego – najgorszego z objawów polio, które może czynić chorych niezdolnymi do kontroli całych grup mięśni, nawet tych które odpowiedzialne są za oddychanie.

Alarmy o zasięgu ogólnoświatowym dotyczące polio rozbrzmiały w pierwszych dniach 2001 roku, kiedy wybuchła epidemia na wyspie Hispaniola na której znajdują się państwa Haiti i Republika Dominikany. David Brown donosił w gazecie Washington Post, że „zmutowany” wirus polio pochodzący ze szczepów z doustnej szczepionki przeciw polio wydawał się rozszaleć na tej karaibskiej wyspie w drugiej połowie 2000 roku.3

Kiedy amerykańskie Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorób [CDC] zbadało te przypadki, ujawniono kolejną tajemnicę: tylko 1/3 przypadków porażenia była związana z wirusem polio. W okresie od 12 lipca do 18 listopada 2000 roku CDC zidentyfikowało 19 mieszkańców Republiki Dominikany u których rozwinęło się ostre porażenie wiotkie (AFP – acute flaccid paralysis, znamienny objaw infekcji polio jak również samodzielny zespół objawów). Jednak wirus polio został wykryty tylko u sześciu z tych osób. Przyczyny pozostałych przypadków porażenia pozostały nieznane.25

Tajemnica ta pogłębia się gdy zbadamy statystyki WHO odnośnie AFP i zakażeń wirusem polio w Republice Dominikany w ciągu ostatnich kilku lat. Chociaż liczba przypadków AFP na Dominikanie w latach 1996 – 1999 wynosiła od 4 do 24 rocznie to nie wykryto żadnego przypadku wirusa polio.

Jeśli dalej będziemy badać inne statystyki WHO dotyczące AFP związane z wirusem polio oraz te w których wirus ten nie został wykryty, to stanie się jasny uderzający fakt: najczęstsze przypadki ostrego porażenia wiotkiego nie są związane z wirusem polio.

Fakt ten budzi nowe nurtujące pytania włącznie z tym czy w USA i Kanadzie faktycznie miała miejsce epidemia zakażeń wirusem polio. W znacznym stopniu istniała zwiększona częstość występowania AFP, w wyniku której wiele dzieci (i dorosłych) zostało sparaliżowanych lub zmarło. Ponieważ wiele z tych przypadków wykazywało wszystkie typowe cechy dla infekcji polio jak gorączka, sztywność szyi, silny ból głowy, bóle mięśni i gardła, a w ciężkich przypadkach paraliż  i występowanie całego zespołu tych objawów to założono, że są one spowodowane przez łatwo przenoszonego wirusa polio.

Jednakże czy rzeczywiście te dolegliwości były spowodowane przez tego wirusa? Jeśli nie to jaka jest przyczyna cierpień na te przypadłości w rejonach świata ubogo wyposażonych na radzenie sobie z takimi schorzeniami? Czy prawidłowym jest zakładać, że to wirus polio powoduje większość przypadków porażenia?

Co to jest poliomyelitis?

Słowo „poliomyelitis” pochodzi od dwóch greckich słów: polio – czyli szary, oraz myelitis – zapalenie rdzenia kręgowego. Poliomyelitis może uczynić kaleką, a nawet zabić w ciągu kilku dni osoby szczególnie narażone, zwłaszcza dzieci. Często dotyka bardzo młodych, dlatego też również nazywane jest porażeniem dziecięcym. U niektórych osób rozwijają się tylko objawy grypopodobne bez porażenia. Może dojść do aseptycznego zapalenia opon mózgowych (obrzęk błony otaczającej mózg). Lekkie objawy podczas chorowania na poliomyelitis cechuje lekka gorączka, złe samopoczucie, ból głowy, ból gardła i wymioty. Pacjenci zwykle całkowicie dochodzą do siebie w ciągu 24-72 godzin. Poliomyelitis bez paraliżu jest klinicznie nie do odróżnienia od aseptycznego zapalenia opon mózgowych wywołanych przez inne czynniki zakaźne. Co zaskakujące, mniej niż jeden na 100 przypadków (a może nawet jeden na 1.000 przypadków) zakażeń wirusem polio powoduje jakiekolwiek oczywiste objawy, nawet w czasie epidemii.23,24

Paraliż w następstwie poliomyelitis jest wynikiem zapalenia i niszczenia neuronów motorycznych w szarej materii rdzenia kręgowego i mózgu. Typ lub stopień wywołanego paraliżu zależy od lokalizacji i stopnia zniszczenia neuronów motorycznych i może wahać się od lekkich po ciężkie porażenia kończyn, aż do porażenia mięśni odpowiedzialnych za oddychanie. Żelazne płuca wykorzystano w latach czterdziestych i pięćdziesiątych, aby wspomagać dzieci, które nie mogły oddychać samodzielnie.

Żelazne płuca - respirator

Na starych fotografiach żelazne płuca prezentowały się strasznie, ale wiele dzieci całkowicie wyzdrowiało. Jednakże, paralityczne poliomyelitis jest śmiertelne w 2-10% przypadków.24

Z wyjątkiem pacjentów, którzy cierpią na niewydolność oddechową, leczenie poliomyelitis jest objawowe. Podawane są nienarkotyczne środki przeciwbólowe, stosowane są gorące okłady oraz fizykoterapia.

Co to jest wirus polio?

Pomimo uszkodzeń jakie powoduje w tkance nerwowej, wirus polio został umieszczony w rodzinie enterowirusów żyjących w układzie pokarmowym. Składa się z pojedynczej nici RNA zamkniętej w otoczce białkowej, która chroni go przed atakami ze środowiska (inaktywacja). Polio wirus jest dosyć mały według standardów wirusowych (22-32 nanometrów). Uważa się, że ludzie są jedynymi gospodarzami wirusa polio, dlatego WHO wprowadziło program eradykacji wirusa polio. Według CDC, jedyne potwierdzone przypadki paraliżu związanego z wirusem polio w Stanach Zjednoczonych od 1979 roku związane są z doustną żywą szczepionką OPV.24,31 W rzeczywistości CDC stwierdza, że zarówno laboratoryjny nadzór enterowirusów, jak i nadzór nad przypadkami polio wskazują, że endemiczny obieg rdzennego dzikiego wirusa polio w Stanach Zjednoczonych ustała w latach sześćdziesiątych.24 Inni badacze kwestionują wniosek CDC, że cyrkulacja dzikiego wirusa polio w Stanach Zjednoczonych ustała cztery dekady temu.

 

Poszukiwanie czynnika przenoszącego poliomyelitis.

 

Poliomyelitis stało się istotną obawą dotyczącą zdrowia publicznego kiedy po raz pierwszy rozprzestrzeniło się po wschodnim wybrzeżu USA, a także w zindustrializowanych rejonach Europy na początku XX wieku.

Epidemie o niewyjaśnionym pochodzeniu były przerażające zarówno dla społeczeństwa jak i dla personelu medycznego, w tym Simona Flexnera i Paula A. Lewisa (obaj zatrudnieni w Instytucie Rockefellera ds. Badań Medycznych w Nowym Jorku) kiedy napisali w Dzienniku Amerykańskiego Towarzystwa Medycznego [JAMA] w 1909 roku: „Przyczyny i sposób rozprzestrzenianie się choroby (poliomyelitis) są nieznane; zatem nie istnieją żadne racjonalne środki zapobiegawcze. Mimo, że nasilenie i śmiertelność tej choroby wahają się znacznie, to jej skutki są zawsze tak katastrofalne, iż sprawiają że jest to problem o najwyższym znaczeniu medycznym i społecznym.”14

Zaledwie rok wcześniej austriaccy badacze Karl Landsteiner i Erwin Popper dokonali historycznego przełomu w badaniu poliomyelitis. Landsteiner leczył 9 letniego pacjenta dotkniętego poliomyelitis, który zmarł 18 listopada 1908 roku po zaledwie czterech dniach choroby. Wraz ze swym kolegą Popperem utworzył zawiesinę z rdzenia kręgowego dziecka i wstrzyknął ją dwóm małpom, a także kilku królikom, świnkom morskim i myszom. Podczas gdy inne zwierzęta nie odczuły skutków tych zastrzyków to u obu małp rozwinęły się patologiczne zmiany w ich rdzeniach kręgowych i mózgach, które wydawały się nierozróżnialne od tych stwierdzonych u ludzi cierpiących na poliomyelitis. U jednej z małp rozwinął się ostry paraliż w obrębie obu nóg. Choć Landsteiner i Popper próbowali przenieść paraliż na inne małpy używając tkanek układu nerwowego chorych małp to jednak zakończyło się to niepowodzeniem.10,20

Karl Landsteiner - Erwin Popper

Karl Landsteiner i Erwin Popper

W kolejnym roku Flexner i Lewis osiągnęli sukces tam gdzie nie udało się to Landsteinerowi i Popperowi. Flexner i Lewis opisali w Dzienniku Amerykańskiego Towarzystwa Medycznego, że udało im się przekazać poliomyelitis poprzez kilka małp (tj. z małpy na małpę). Zaczęli oni podobnie jak Landsteiner i Popper od wstrzykiwania zakażonych tkanek ludzkiego rdzenia kręgowego do mózgów małp. Po tym jak małpa zachorowała, brano zawiesinę z rdzenia kręgowego i wstrzykiwano innym małpom. Praca Flexnera i Lewisa z 1909 r. została uznana za przełom ponieważ u drugiej małpy (a także u trzeciej, czwartej, piątej i przynajmniej szóstej do czasu publikacji) rozwinęło się poliomyelitis. Flexnerowi i Lewisowi udało się z powodzeniem przekazać czynnik chorobotwórczy od zwierzęcia na inne zwierzę.14

Jednak czym w istocie był ten czynnik? Flexner i Lewis donieśli, że

„Nie udało się nam ostatecznie wykryć bakterii zarówno w próbkach preparatów, ani w kulturach które można by przypisać tej chorobie.”

W związku z tym stwierdzili:

„ … czynnik infekcyjny poliomyelitis musi należeć do klasy małych i przenikalnych wirusów, które jak dotąd nie zostały jeszcze wykryte pod mikroskopem.”

Czy Flexner i Lewis zdołali wyodrębnić wirusa polio w 1909 roku? Z perspektywy czasu można zauważyć, że wczesne eksperymenty próbujące wyizolować wirusa polio mogły także zawierać inne czynniki.

Dyskusja nad naturą czynnika przenoszącego poliomyelitis była wciąż kontynuowana. Jeden z zespołów badawczych w 1919 roku spekulował, że rodzaj bakterii ostrożnie nazwanych „poliococus” był albo sprawcą, albo czynnikiem współzależnym.7 We wczesnych eksperymentach, wszelkiego rodzaju materiał biologiczny z rdzenia kręgowego, mózgu, kału a nawet much, który został zamieniony na próbki i wstrzykiwany organizmom małp by spowodować paraliż.4.7.15.21.22.33 Te wczesne „preparaty wirusowe” były znane z tego, że zawierają bakterie. Ilość bakterii była określona przez obsiewanie płytki do hodowli materiału biologicznego emulsją z rdzenia kręgowego (lub kału) by zbadać ile czasu zajmie aż pojawi się kolonia bakterii.

Jak wskazał F.B. Gordon i jego współpracownicy w artykule opublikowanym w Journal of Infectious Diseases [Dziennik Chorób Zakaźnych]:

„Jeśli nie było żadnego (bakteryjnego) wzrostu po około 22 godzinach inkubacji w temp. 37°C to próbka była uznawana za odpowiednią do wstrzykiwania małpom. To nie był właściwie test sterylności, gdyż wzrost mógł wystąpić po dłuższym czasie inkubacji; był to raczej wskaźnik ilości zanieczyszczeń bakteryjnych w badanej próbce.”15

Wcześni badacze wirusa polio wiedzieli, że „wirus” który wstrzykiwali małpom zawierał także nieokreśloną ilość bakterii. Jednak nie mieli sposobu na określenie co jeszcze mogło być w niej obecne.

Chociaż Flexner i Lewis mogli być w błędzie zakładając, że przenoszą badanym małpom „oczyszczonego wirusa” to jednak na pewno przenosili czynnik (lub czynniki) chorobotwórcze z zwierzęcia na zwierzę. Chociaż nie mogli właściwie zobrazować tego czynnika to opisali go możliwie najdokładniej jak tylko byli w stanie. W ten sposób niewątpliwie przysłużyli się innym badaczom, choć mogli przekazać swoje wnioski w sposób, który prześladuje badaczy poliomyelitis przez dziesięciolecia.

Na początku XX wieku gdy naukowcy próbowali zrozumieć i scharakteryzować wirusy i choroby wirusowe to wielu z nich w tym badacze poliomyelitis jak Flexner i Lewis wyolbrzymiło swoje odkrycia.

Wcześni badacze poliomyelitis byli na tym polu prawdziwymi pionierami naukowymi: Flexner, Lewis, Dalldorf, Landsteiner, Popper, Dulbecco, Sabin, Salk i wielu innych pracowało nad nieznanymi czynnikami chorobotwórczymi. Nie rozumieli właściwości zakażonych tkanek z którymi przyszło się im obchodzić i nie wiedzieli jak chronić samych siebie przed chorobami, które mogą zawierać te tkanki. Ich odwaga w podejmowaniu takiego ryzyka nigdy nie powinna zostać niedoceniona, zwłaszcza w naszych czasach gdy lateksowe rękawiczki, dobrze zabezpieczone pojemniki do przechowywania materiałów biologicznych i wiele innych metod chronienia badaczy przed niebezpiecznymi czynnikami chorobotwórczymi jest łatwo dostępna.

Niemniej jednak ci wcześni badacze działający na początku XX wieku nie powinni otrzymywać taryfy ulgowej za brak precyzji w opisywaniu swoich eksperymentów i ich rezultatów.

Np. w 1948 roku Gilbert Dalldorf i Grace M. Sickles ze Stanowego Wydziału Zdrowia Nowego Jorku opublikowali raport z badań, który obrazuje pewne problemy związane z wirusologią, utrzymujące się nawet do dzisiaj. Dalldorf i Sickles opisali „niezidentyfikowany, możliwy do odfiltrowania czynnik” który udało im się „wyizolować” z kału sparaliżowanych dzieci.

Problem stał się jasny kiedy Dalldorf i Sickles opisali jak „wyizolowali” ten czynnik:

„20% zawiesinę z kału przygotowano poprzez potraktowanie eterem i odwirowanie. Następnie wszczepiono śródmózgowo myszom albinosom [szczep laboratoryjny]. Oseski w wieku 3-7 dni zostały sparaliżowane, podczas gdy myszy o wadze od 10 do 12 gram nie sparaliżowało. Wyizolowanie powtórzono kilkakrotnie.”

Dalldorf i Sickles użyli słowa „wyizolowanie” by opisać ich utworzenie zawiesiny z materiału fekalnego, co delikatnie mówiąc było olbrzymią przesadą.

Dalldorf i Sickles następnie usiłowali zidentyfikować czynnik chorobowy. W 1948 roku przeciwciała, podobnie jak wirusy nie mogły być tak scharakteryzowane jak obecnie.

Do różnicowania pomiędzy szczepami wirusa została użyta „neutralizująca surowica” – niekomórkowa część krwi pobrana od osoby lub zwierzęcia u którego domniemywano, że jest zarażone tym czynnikiem chorobowym. Ta neutralizująca surowica prawdopodobnie zawierała przeciwciała przeciwko czynnikowi chorobowemu.

Według Dalldorfa i Sicklesa neutralizująca surowica pobrana od sparaliżowanych dzieci zatrzymała porażenie u myszy kiedy wstrzyknięto jednocześnie surowicę i zawiesinę zawierającą ten nieokreślony czynnik chorobowy.

Ten brak dowodu, czyli fakt iż u myszy nie rozwinął się paraliż, został zinterpretowany w ten sposób, że czynnik chorobowy wstrzyknięty myszom został skutecznie powstrzymany przez tę neutralizującą surowicę (tj. przez odpowiedź immunologiczną chorego dziecka). Nie było jednak dowodu jak twierdzili Dalldorf i Sickles, że ta neutralizująca surowica reaguje i powstrzymuje ten jeden konkretny czynnik chorobowy.

Dalldorf i Sickles wierzyli, że „wyizolowali” nowy czynnik chorobowy, który mógł zakażać ludzi. Jednak nie twierdzili, że jest on odpowiedzialny za powodowanie paraliżu u swoich pacjentów. Jak napisali

„Pacjenci których badaliśmy, prawdopodobnie zostali przypadkowo zarażeni tym nowym czynnikiem chorobowym oraz klasycznym wirusem poliomyelitis, choć próby wyizolowania go nie zakończyły się powodzeniem (wywołania choroby) u małp rezusów.” 6

Ponownie pisali oni o „wyizolowaniu” kiedy odnosili się do częściowo przetworzonych próbek (tkanek rdzenia kręgowego lub fekaliów) pobranych od porażonych osób i wstrzykiwanych zwierzętom w celu sprawdzenia czy rozcieńczona próbka spowoduje paraliż. Prawdziwe wyizolowanie nie miało tu jednak miejsca.

 

Czy wirus polio został naprawdę kiedykolwiek wyizolowany?

 

Artykuł ten porusza kwestię wiary współczesnej medycyny w to, że wirus polio został wyizolowany, opisany, w pełni zrozumiany i zmierza ku wymarciu dzięki agresywnym szczepieniom/program eradykacji wirusa polio. Jednak ostatnia epidemia na Dominikanie pokazuje, że jeszcze daleko nam do eradykacji poliomyelitis, mimo iż powszechnie w to wierzymy.

Co więcej, podczas gdy czynnik chorobowy zidentyfikowany jako wirus polio był z pewnością hodowany pod koniec lat 40 XX wieku, to czy wiemy na pewno, że został naprawdę wyizolowany, tj. czy był hodowany w czystej postaci bez żadnych zanieczyszczeń? Obecnie wiemy, że przypadkowe („pasażerowie”) wirusy takie jak SV40 są powszechnie w tkankach małp, które wcześni badacze wirusa polio wykorzystywali do hodowli komórkowych. Choć te czynniki najwidoczniej nie powodują szkód u małp to w przypadku przedostania się do organizmu człowieka ich długoterminowe skutki pozostają do ustalenia.

dr Wolfgang K. Joklik

Około 90 lat po opublikowaniu raportu Landsteinera i Poppera w którym opisywali sukces w zarażaniu poliomyelitis u małp  dr Wolfgang K. Joklik przeanalizował wszelkie postępy na tym polu w swojej dyscyplinie naukowej – wirusologii.19 Okazją była również 100 rocznica Amerykańskiego Towarzystwa mikrobiologicznego i samej wirusologii jako dziedziny. Pełniąc funkcję redaktora naczelnego pisma Virology (Wirusologia) i redaktora  Journal of Virology (Dziennika Wirusologicznego)  będąc profesorem mikrobiologii Joklik był wyjątkowo predysponowany, aby ocenić co dowiedzieliśmy od czasu wczesnych eksperymentów w dziedzinie wirusologii.

Jeszcze przed założeniem pisma Virology i Journal of Virology w latach 50 i  60– tych, Joklik zauważył, że w różnych czasopismach pojawia się spora ilość „epokowych odkryć w dziedzinie wirusologii”, które bynajmniej nie były związane z tą dziedziną. Z pośród siedmiu odkryć wydzielił on dwa, które dotyczyły badań nad paraliżem. Pierwsze to

„odkrycie Endersa i innych z 1949 roku, że wirus poliomyelitis może być hodowany in vitro w komórkach ludzkich tkanek embrionalnych co stanowiło podstawę techniki hodowli tkanek (hodowla pojedynczych komórek)”; a druga to „demonstracja dokonana przez Dulbecco, także w 1952 roku wykazująca, że wirus zwierzęcy zdolny jest do tworzenia łysinki w monowarstwach sklonowanych komórek hodowlanych co dało zaczątek dziedzinie zwierzęcej wirusologii molekularnej.”19

Mimo iż w 1952 roku Dulbecco nie zajmował się w swych badaniach wirusem polio to bezpośrednio prowadziło to do jego publikacji z 1954 roku, w której rozszerzył nową metodologię na badania nad wirusem polio.8,9

W 1949 roku jak wspomniał Joklik, John F. Enders – badacz z Harvard Medical School (Wydziału Medycyny Uniwersytetu Harvarda) razem z współpracownikami – Thomasem H. Weller (członkiem wydziału zdrowia publicznego USA) i Frederickiem C. Robbinsem (starszym asystentem na Wydziale Chorób Wirusowych w Krajowej Radzie Badawczej [Virus Diseases of the National Research Council ]) wykazali, że wirus polio może być hodowany nie tylko w hodowlach komórkowych, ale może być także replikowany w tkankach nie nerwowych, co było rewelacyjnym odkryciem w tamtym czasie.13 Już wcześniej podejrzewano, że wirus polio może egzystować w jelitach zarażonych osób. Jednak nikt nie był w stanie rozmnożyć tego wirusa w tkance jelitowej, głównie z powodu bakterii które naturalnie tam egzystują. Enders i jego koledzy odnieśli częściowy sukces gdyż podali antybiotyk (penicylinę i/lub streptomycynę) do ich hodowli komórkowych by zabić owe bakterie. Technika ta nie była jeszcze oczywiście dostępna dla badaczy działających przed II Wojną Światową.

Praca Endersa i jego współpracowników z 1949 roku jest powszechnie uznawana za punkt zwrotny w badaniach nad poliomyelitis. Wielu badaczy, włącznie z pracującymi pod patronatem WHO by doprowadzić wirus polio do eradykacji, jest pełnych uznania dla tych zasług naukowych uznając, że utorowało to drogę pod rozwój szczepionek Salka i Sabina przeciwko wirusowi polio, mimo że wirus polio nie został właściwie przez owych naukowców wyizolowany. Natomiast udało im się wyhodować w ludzkich tkankach embrionalnych „możliwy do odfiltrowania czynnik” co do którego założyli, że jest wirusem polio. Podobnie jak Landsteiner i Popper 40 lat wcześniej, tak każdy zajmujący się tą dziedziną podczas pierwszych 60 lat lub więcej Enders i jego współpracownicy nazywali ową zaraźliwą zawiesinę tkankową mianem „wirusa”.

Pomimo tego wyolbrzymienia, Enders, Weller i Robbins jako pierwsi udowodnili, że ów zaraźliwy czynnik związany z poliomyelitis może być rozmnażany w komórkach w laboratorium, a hodowle komórkowe mogą zastąpić żywe zwierzęta w badaniu takiego zaraźliwego czynnika. W 1954 roku ich przełomowa praca została nagrodzona Nagrodą Nobla.

Nobel 1954 - Enders, Weller i Robbins

Uważa się, że publikacja Renato Dulbecco z 1952 roku wychwalana przez Joklika w znaczący sposób przyczyniła się do badań nad wirusami w ogóle oraz przez ekstrapolację w badaniach nad wirusem polio. Pracując w Kalifornijskim Instytucie Technologicznym [California Institute of Technology] w Pasadena, Dulbecco opracował metodę rozwoju płytek komórkowych dzięki czemu „łysinki wirusowe” mogły zostać zwizualizowane. Wyhodował wirusowe łysinki zachodniego wirusowego końskiego zapalenia mózgu na podłożu komórkowym z zarodków kurzych, a kiedy opublikował swoją pracę stwierdził, że wciąż nie wiadomo czy wszystkie wirusy można hodować w ten sposób.

Były to faktycznie najwcześniejsze dni współczesnych badań wirusologicznych. Dulbecco wyraził swoją nadzieję, że pewnego dnia badacze będą w stanie odróżnić różne wirusy hodowane w kulturach komórkowych poprzez stosowanie jego metodologii i badanie powstałych łysinek pod mikroskopem.8

W 1954 roku Dulbecco i jego współpracowniczka Margaret Vogt opublikowali klasyczny artykuł badawczy (zobacz poniżej na: Eksperyment „izolowania” przeprowadzony przez Renato Dulbecco.), który określa standardy oczyszczania kultur wirusa polio już od dziesięcioleci.9 Dulbecco i Vogt, podobnie jak ich współpracownicy używali komórek nerkowych małp do hodowli tkanek o których myśleli, że zawierają wirusa polio. Dulbecco i Vogt objaśnili skąd pochodzi „wirus”, którego hodowali:

„Wirus został dostarczony w postaci 20% zawiesiny z tkanki rdzenia kręgowego małpy rezusa w  wodzie destylowanej. Typ 1 wirusa został pozyskany poprzez przepuszczenie go przez monowarstwę kultury komórek nerkowych. Typ 2, szczep Yale-SK oraz typ 3, szczep Leon, zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr. J.L. Melnicka w formie nadsącza kultury tkankowej.”9

Innymi słowy: Dulbecco i Vogt bynajmniej nie wyizolowali czystego wirusa polio w żadnym ze swych eksperymentów opisanych w 1954 roku. Kiedy opisywali sianie ich kultur „wirusem” to w rzeczywistości używali do tego nieoczyszczonej zawiesiny, a nie czystego wyizolowanego wirusa.

Z tego historycznego przeglądu wczesnych prac badaczy poliomyelitis jasno wynika, że żaden z nich tak naprawdę nie wyizolował wirusa polio. Ponadto wstrzykiwali małpom eksperymentalne płyny, które prawdopodobnie były zanieczyszczone innymi czynnikami chorobotwórczymi.

Jeszcze bardziej dezorientujący (ale nie omawiany tutaj) jest fakt, że enterowirusy inne niż wirus polio są związane z AFP (ostrym porażeniem wiotkim – acute flaccid paralysis). Na przykład w lutym 2001 roku wykazano, że wirus Coxsackie A24 jest powiązany z niebędącym polio ostrym porażeniem wiotkim.5

 

Jak wiele przypadków porażenia wiotkiego nie jest spowodowanych przez wirusa polio?

 

Zaskakująco duża liczba przypadków porażenia na świecie nie jest bynajmniej związana z wirusem polio. Jeśli zajrzysz na internetową stronę WHO gdzie podawane są dane zarówno na temat ostrego porażenia wiotkiego jak i niebędącym polio ostrym porażeniem wiotkim to zobaczysz, że świat wcale nie został jeszcze uwolniony od plagi AFP. Na przykład w Indiach zgłoszono 9.580 przypadków AFP w 1999 roku; a tylko 2.802 z nich – mniej niż 1/3 była związana z wirusem polio. Chiny zgłosiły WHO 5.064 przypadków AFP w 1999; tylko 1 przypadek z pośród nich był związany z wirusem polio. Tak więc programy szczepień i program eradykacji wirusa polio wcale nie wyeliminowały przypadków porażeń.

WHO niedawno ogłosiła, że Egipt jest już na progu eradykacji (całkowitego wyeliminowania) wirusa polio. „Jesteśmy już na końcu ery polio” powiedział w lutym 2001 roku dziennikowi Reuters urzędnik UN Children’s Fund Project (UNICEF – Fundusz Narodów Zjednoczonych na rzecz Dzieci). Według Reuters w Egipcie „jak do tej pory w tym roku nie zgłoszono ani jednego przypadku paraliżującego wirusa” lub w 2000 roku.17

Według WHO na ich stronie internetowej ze statystykami AFP/polio w 2000 roku miały miejsce 54 przypadki ostrego porażenia wiotkiego (najbardziej aktualne dane statystyczne). W 1999 roku 9 przypadków ostrego porażenia wiotkiego (AFP) zostało sklasyfikowanych jako spowodowane wirusem polio, a 276 zostało sklasyfikowanych jako AFP nie będącym polio.

W 1998 roku w Egipcie miało miejsce 295 przypadków AFP, z czego 35 sklasyfikowano jako związane z wirusem polio. W 1997 roku zarejestrowano 217 przypadków porażenia nie związanego z polio w porównaniu z 14 przypadkami w których potwierdzono infekcję wirusem polio. W 1996 – najwcześniejszym roku dla którego dostępne są dane statystyczne, w Egipcie zarejestrowano 309 przypadków AFP. Sto z tych przypadków zostało sklasyfikowanych jako związane z wirusem polio, a pozostałe 209 przypadków „dwie trzecie całości” prawdopodobnie były spowodowane inną przyczyną niż wirus polio (z zastrzeżeniem że statystyki epidemiologiczne nie są w pełni dokładne w każdym kraju).

Afganistan jest kolejnym krajem w którym następuje wzrost częstości występowania AFP w porównaniu z malejąca liczbą występowania wirusa polio. W cotygodniowym raporcie o zachorowalności i śmiertelności (MMWR – Morbidity and Mortality Weekly Report ) wydawanym przez CDC z 2 marca 2001 roku, odnotowano, że

„W  latach 1999 – 2000 liczba przypadków AFP (w Afganistanie) wzrosła z 230 do 253 a liczba przypadków wyizolowanego dzikiego wirusa polio z pośród przypadków AFP spadła z 63 do 28.”28

Jak CDC wyjaśnia wzrost przypadków AFP w Afganistanie w obliczu prężnej kampanii eradykacji wirusa polio? Cóż, nie wyjaśnia tego. W rzeczywistości w raporcie MMWR wzrost przypadków AFP nie związanych z polio brzmi nieomal jak triumf zdrowia publicznego:

„W  latach 1999 – 2000 liczba przypadków AFP nie związanych z polio prawie podwoiła się, a liczba rejonów w których prowadzane są Krajowe Dni szczepień [NID – National Immunization Days] stale rośnie. Staranne planowanie i nadzór nad szczepieniami przeprowadzanymi dom po domu oraz wsparcie ze strony rosnącej liczby partnerów lokalnych, poskutkowało jak do tej pory najwyższym wskaźnikiem wyszczepienia dzieci. Monitorowanie przez organizacje pozarządowe, agencje ONZ oraz lokalne władze znacząco zwiększyły oddziaływanie NID.”28

Innymi słowy im więcej organizowano Krajowych Dni Szczepień tym więcej pojawiało się przypadków paraliżu. Czy to znaczy, że szczepienia powodowały porażenie? Nie, ale również wzrost przeprowadzonych szczepień nie uchronił dzieci od porażenia.

Na półkuli zachodniej również zaobserwowano wzrost przypadków AFP. Jak już wspomniano wcześniej wyspa Hispaniola (Haiti i Dominikana) doświadczyła tego co CDC nazwało „wybuchem epidemii poliomyelitis”, która zaczęła się w lipcu 2000 roku. Na Dominikanie odnotowano 54 przypadki z czego 12 z nich było według CDC „laboratoryjnie potwierdzonymi przypadkami poliomyelitis przypisywanymi wywodzącemu się ze szczepionki szczepowi wirusa polio typ 1”. Wiadomo, że doustna szczepionka przeciwko polio wywołuje rozwój tej choroby u 1 na 750.000 niemowląt, które ją otrzymały lub matka tego niemowlęcia. W przeciwieństwie do szczepionki Salka, doustna szczepionka Sabina zawiera żywe wirusy. 45 przypadków przytoczonych w styczniu 2001 roku w Washington Post, jeśli zostaną potwierdzone, to wyraźnie pozostaną poza zasięgiem tej statystyki.3

Pod koniec lutego 2001 roku przyczyny 33 przypadków AFP na Dominikanie oraz 3 na Haiti nie zostały jeszcze ustalone.27 Wszystkie te przypadki mogą być spowodowane doustną szczepionką przeciw polio. Jeśli tak, to w takim przypadku rozwiązałoby to tajemnicę i odpowiadałoby to na pytanie, jakie czynniki przyczyniły się do tak wielkiej epidemii porażeń związanych ze szczepieniami.

Jeśli owe 36 przypadków nie są związane ze szczepieniami przeciwko polio to jaka była ich przyczyna? Co innego jest przyczyną dużej ilości zachorowań na AFP nie związane z wirusem polio rozpoznawanych przez WHO na całym świecie?

W przypadkach w których wirus polio jest wskazywany jako winny epidemii, to jak precyzyjne są aktualne metody, które stosują wirusolodzy by go wyizolować i zidentyfikować?

Zalecenia CDC dotyczące szczepień przeciwko polio

Zalecenia dla dzieci w Stanach Zjednoczonych obejmują szczepienie 4 dawkami inaktywowaną szczepionką przeciwko poliowirusowi (IPV) podawane w wieku 2, 4, pomiędzy 6 a 18 miesiącem oraz pomiędzy 4 a 6 rokiem życia. Niezaszczepione osoby dorosłe powinny otrzymać trzy dawki IPV, pierwsze dwie dawki w odstępach 4 do 8 tygodni, a trzecia dawka w odstępie 6 do 12 miesięcy po drugim szczepieniu. Jeśli trzy dawki nie mogą być podawane w zalecanych przedziałach czasowych przed uzyskaniem koniecznej ochrony, to zostanie zaproponowany alternatywny harmonogram podania szczepionek. Osobom niezaszczepionym w pełni, zaleca się dokończenie serii szczepionką IPV. Dawki przypominające szczepionki IPV mogą być brane pod uwagę u osób, które wcześniej ukończyły pełną serię szczepień przeciwko polio, a które mogą podróżować na obszary, gdzie polio występuje endemicznie. – Morbidity and Mortality Weekly Report, March 2, 2001, Vol. 50, No. 8, p. 147

 

Jak obecnie jest wykrywany wirus polio?

 

Jest prawie niewyobrażalnym jak precyzyjna i wyrafinowana stała się technologia laboratoryjna w ciągu ostatnich 30 lat. Jako, że na początku 2001 roku zanalizowaliśmy całą sekwencję ludzkiego genomu, to  trudno sobie wyobrazić, że dopiero w latach 70- tych XX wieku naukowcy rozwinęli technologię, która umożliwiła szybkie sekwencjonowanie genów, w tym sekwencji genetycznych zakaźnych czynników jak bakterie i wirusy.

Ta nowa metodologia sekwencjonowania została niezwłocznie zastosowana do badań nad wirusem polio. W latach 70- tych CDC zaczęło rutynowo przeprowadzać testy genotypowe („sekwencjonowanie molekularne” lub „genetycznego odcisku palca”) na próbkach kału pobranych od pacjentów podejrzanych w czasie epidemii polio by ustalić czy wirus był u nich obecny. Odkrycia dokonane dzięki nowej technologii wykorzystano do ekstrapolacji na poprzednią dekadę. Obecnie w dokumentach CDC pisze:

„zarówno laboratoryjny nadzór enterowirusów, jak i nadzór przypadków polio wskazują na to, że endemiczna cyrkulacja rodzimego dzikiego wirusa polio została zatrzymana w USA w latach 60- tych XX wieku.”24

Zgodnie z obecnymi wytycznymi CDC i WHO, aby wykryć wirusa polio, należy pobrać dwie próbki kału od każdego pacjenta, oddane w odstępie 24 – 48 godzin, w ciągu 14 dni od wystąpienia paraliżu i muszą one być dostarczone do laboratorium „w dobrym stanie”. Mimo, że celem WHO jest uzyskanie dwóch dobrych próbek w przynajmniej 80% wszystkich przypadków AFP, to niektóre rejony świata nie spełniają tego warunku zbliżając się jedynie do 50%.28

CDC dostarcza następujące wytyczne dotyczące wykrywania wirusa polio:

„Na próbkach zebranych od osób podejrzewanych o zachorowanie na polio powinny być przeprowadzone następujące badania:

a) Wyizolowanie wirusa w hodowli tkankowej;
b) Serotypowanie wyizolowanego wirusa polio jako serotypu 1,2 lub 3;
c) Dyferencjacja intratypowa z zastosowaniem sondy hybrydyzacyjnej DNA/RNA lub reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR] w celu określenia czy wyizolowany wirus jest związany ze szczepem pochodzącym ze szczepionki lub dzikim wirusem.

Próbki surowicze fazy ostrej oraz fazy zdrowienia powinny być analizowane pod kątem przeciwciał neutralizujących każdego z trzech serotypów wirusa polio. Czterokrotny wzrost miana przeciwciał w próbkach surowicy fazy ostrej do fazy zdrowienia wskazuje na zarażenie wirusem polio. Dla wirusa polio należy stosować ostatnio poprawiony protokół badania serologicznego. Komercyjne laboratoria zwykle wykonują badania uzupełniające i inne testy. Jednakże inne badania niż neutralizacja są trudne w interpretacji z powodu nieodpowiedniej standaryzacji oraz względnej niewrażliwości.”24

Choć procedura ta jest uznaną metodą wykrywania wirusa polio i odpowiedzi organizmu na jego obecność, to nie „wyizolowuje” wirusa polio, tylko po prostu go wykrywa. Próbki badane przez CDC i WHO powinny być opisywane jako „materiał reaktywny przeciw wirusowi polio” a nie jako próbki zawierające wyizolowanego, czystego wirusa.

Po raz kolejny nie mamy dowodu na to, że wirus polio został wyizolowany.

Jeśli nie wirus polio, to co powoduje dzisiejsze przypadki porażenia wiotkiego?

„Historia etiologii poliomyelitis jest historią popełnionych błędów.”J.F. Eggers, czasopismo Medicine, 1954 r.

Jeśli większość populacji USA została zaszczepiona od lat 50- tych to dlaczego „eradykacja” wirusa polio na terenie USA trwała aż do 1979 roku?24,31

Szczepionka przeciw poliomyelitis

A także co powoduje przypadki porażenia nie związanego z polio, które wciąż występują na całym świecie?

Staje się jasnym, że jednym z winowajców zdolnym do spowodowania nie tylko paraliżu, ale również innych neurologicznych dolegliwości są pestycydy fosforoorganiczne. Niedawno przeprowadzone badania wykazały, że długotrwała ekspozycja na pestycyd fosforoorganiczny powoduje rozwój objawów choroby Parkinsona na modelu zwierzęcym.2 Badacze z Paragwaju mają dowody na to, że duża ilość zachorowań na AFP wśród dzieci w latach 1990 – 1991 była związana z ekspozycją na pestycyd fosforoorganiczny.

Pięćdziesiąt paragwajskich dzieci zidentyfikowanych w tym badaniu, z uwagi na to, że przeprowadzano je w wiejskim, odseparowanym rejonie oznaczało, jak zauważyli badacze, że duża liczba dotkniętych dzieci mogłaby zostać wykluczona z badania. Rozwinął się u nich pewien rodzaj AFP, który nazywa się Zespołem Guillaina-Barrégo [GBS].

W przypadku Zespołu Guillaina-Barrégo, podobnie jak w innych formach AFP otoczka mielinowa, która otacza i chroni nerwy jest uszkodzona. Przyczyny choroby są nieznane, ale ogólnie sądzi się, że jest to schorzenie autoimmunologiczne sprowokowane przez infekcje, toksyny lub połączenie obu tych czynników.16

Dzieci chorowały podczas paragwajskiego lata (od stycznia do kwietnia). Dolegały im osłabienie, zakażenie górnych dróg oddechowych, gorączka oraz objawy ze strony układu pokarmowego. U trojga dzieci rozwinęły się trudności z oddychaniem. Dwoje z nich wymagało pomocy w oddychaniu (konieczność zastosowania intubacji). Badacze stwierdzili, że:

„Osłabienie postępowało według rosnącego wzorca u 95% dzieci a równoczesne we wszystkich kończynach w 5% przypadków; średni czas osiągnięcia nadiru wynosił 7 dni (w zakresie od 2 do 12 dni).”

Z pośród 35 poddanych obserwacji dzieci podczas ostrej fazy AFP, 18 nie było w stanie chodzić, 10  chodziło z czyjąś pomocą, 4 chodziło samodzielnie, a troje było jeszcze zbyt młode by chodzić. U dzieci wystąpił pełny lub częściowy paraliż mięśni twarzy i pęcherza. Doświadczyły również zmian w autonomicznym układzie nerwowym, które powodowały wahania ciśnienia krwi, nieprawidłowe bicie serca, podrażnienia skóry oraz wzmożoną aktywność motoryczną jelit. Jedno z dzieci zmarło.

Badanie zostało przeprowadzone jako część wysiłków Panamerykańskiej Organizacji Zdrowia [Pan American Health Organization] której celem jest eradykacja (całkowite wyeliminowanie) poliomyelitis. David E. Hart z Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udarów Mózgu [National Institute of Neurological Disorders and Stroke] przy Narodowym Instytucie Zdrowia [NIH] w USA był czołowym badaczem pracującym razem z badaczami z paragwajskiego Ministerstwa Zdrowia.16 Większość przypadków którymi się zajmowali była skupiona w wiejskiej, rolniczej prowincji o nazwie Concepcion.

Hart i jego koledzy zasugerowali, że

„skupienie pacjentów w Concepcion może być powiązane ze stosowaniem pestycydów fosforoorganicznych na polach bawełny.”

 

„Rolnicy używają znacznych ilości tych pestycydów, często w stężonej formie a potem puste pojemniki służą dzieciom jako zabawki. Również największe zużycie tych organofosforanów następuje podczas lata (grudzień – marzec )”, kiedy owe dzieci zaczynają chorować.16

Chociaż zauważają iż retrospektywny pomiar ekspozycji na te organofosforany jest bardzo trudny, Hart i jego współpracownicy cytują raport wskazujący, że przemysł bawełniany w 1991 roku oficjalnie wydał 6,7 miliona dolarów na te pestycydy fosforoorganiczne. Niemniej trzeba liczyć się z tym, że ponad połowa pestycydów w Paragwaju jest nabywana „nieoficjalnie”.

„Czworo dzieci zostało wykluczonych z tego badania z powodu ewidentnej ekspozycji na ten produkt oraz wystąpienia ostrego zespołu cholinergicznego” 

– poważnej choroby wywołanej ekspozycją na pestycydy fosforoorganiczne. Hart i jego koledzy dodali również

„Kliniczny przebieg ich choroby był jednak podobny do przebiegu choroby dzieci, które zostały uwzględnione” w badaniu.16

Poprzez badanie możliwości, że owo AFP zaobserwowane u tych paragwajskich dzieci może być związane z pestycydami fosforoorganicznymi, Hart i jego koledzy podjęli dodatkowy krok, który tak często jest pomijany. Skupiska chorób w danych społecznościach mogą powstawać z wielu przyczyn; nie są one wyłącznie związane z czynnikami zakaźnymi. Toksyny w środowisku są znaczącym czynnikiem w wielu schorzeniach.

Od czasów Kocha bakteriolodzy stosują złoty standard, który został przez niego opisany dla przyporządkowania procesu chorobowego do pojedynczych organizmów. Bakterie i grzyby mogą być naprawdę wyizolowane i hodowane niezależnie na sztucznym podłożu. Nie wymagają one obecności ludzkich czy innych komórek. Jednym z problemów jaki napotykają naukowcy w opisywaniu chorób nie związanych z bakteriami  jest założenie, że pojedynczy byt może być ich przyczyną, bez interakcji z komórkami w których rosną, ludzkim genomem lub środowiskiem.

Żyjemy w ważnych czasach: zamierzamy przedefiniować wiele z tego co wiemy o naukach medycznych. Na początku 2001 roku dwa świetne opracowania na temat projektu ludzkiego genomu zostały opublikowane równocześnie w lutowym wydaniu Science and Nature (Nauka i Natura) wywracając wiele z tego co myśleliśmy, że wiemy o ludzkim genomie do góry nogami. Dowiedzieliśmy się na przykład, że ludzki genom nie posiada 100.000 genów, ale tylko około 30.000 czyli mniej od ilości które posiada ryż.1

Nasze nowe zrozumienie ludzkiego genomu zostało umożliwione częściowo dzięki nowym technologiom, które możemy zastosować do przeanalizowania wielu założeń współczesnej medycyny. Jedną z najważniejszych lekcji wyciągniętych dzięki wyzwaniu dekodowania ludzkiego genomu jest to, że naukowcy muszą dokładnie opisywać laboratoryjne eksperymenty i ich wyniki. Zaawansowane technologicznie narzędzia mogą dostarczać szczegółowych i precyzyjnych informacji, ale korzystający z nich naukowcy muszą opisywać te wyniki z jednakową dokładnością. Kiedy próbka jest laboratoryjnie reaktywna to nie powinno być zakładane, że jest ona zakaźna. Podobnie zawiesina z chorej tkanki mózgowej nie powinna być nazywana „wirusem” a rozcieńczanie materiału z tkanki mózgowej nie powinno być nazywane „izolowaniem”.

Ponieważ ludzki genom jest określany coraz bardziej dokładnie to również  i nasze zrozumienie w jaki sposób nasze geny wchodzą w interakcje ze sobą, środowiskiem i innymi organizmami będzie coraz bardziej precyzyjne.

Precyzja powinna mieć również odniesienie do celów badawczych. Oczywiście niepoprawne jest stwierdzenie, że poliomyelitis zostało eradykowane z wielu krajów. Zaskakująco duża liczba przypadków AFP nie związanych z polio na świecie zapewnia kontynuację w dążeniu do pierwotnego celu March of Dimes: eliminacji porażenia dziecięcego.

[March of Dimes – organizacja założona w 1938 r. przez prezydenta USA Franklina D. Rooswelta jako krajowa fundacja do walki z porażeniem dziecięcym.]Na swojej stronie internetowej March of Dimes przypisuje sobie zasłużone uznanie w ograniczaniu ilość porażeń na świecie. Na stronie internetowej pojawia się stwierdzenie, że:

„Historycy nazwali pokonanie polio jednym z największych osiągnięć tego stulecia.”

 

„Dzięki fundacji March of Dimes i milionom ludzi którzy ją wspierali, nie ma już niszczących epidemii, które terroryzowały pokolenia.”

Oczywiście pierwotny cel fundacji March of Dimes nie został jeszcze osiągnięty, bo w przeciwnym razie nie było by obecnie na świecie tak wiele przypadków ostrego porażenia wiotkiego [AFP]. Spojrzenie wstecz na ostatnie 50 lat badań nad poliomyelitis pokazuje, że cel wyeliminowania porażenia dziecięcego został zastąpiony celem wyeliminowania wirusa polio. Skoro rządy, międzynarodowe organizacje i fundacje charytatywne wydają setki milionów dolarów na rzecz eradykacji wirusa polio, to czy nie powinniśmy też inwestować w podstawowe badania, które zapobiegną wszelkim przypadkom porażenia dziecięcego?

Podziękowania: Autor chciałby podziękować dr. Howardowi Urnovitzowi, dyrektorowi  naukowemu  Fundacji Badań nad Chorobami Przewlekłymi [Chronic Illness Research Foundation] za przybliżenie tej historii i zaakceptowanie treści naukowej tego artykułu.

dr. Howard Urnovitz

Eksperyment „izolowania” przeprowadzony przez Renato Dulbecco.

W 1954 roku Renato Dulbecco i jego współpracowniczka Margaret Vogt opublikowali klasyczny dokument badawczy, który od dziesięcioleci wyznacza standard oczyszczania wirusa polio.9 Wprowadzili techniczne innowacje do procesu „oczyszczania” wirusów z hodowli tkankowej. Ta nowa technika została nazwana „oczyszczaniem łysinki [plaque purification]”; pojedyncza łysinka (okrągły obszar komórek zabarwionych inaczej niż otaczające je kultury; przejaśnienia w murawie bakteryjnej) uważano za przedstawiające populację czystego wirusa. W celu oczyszczenia łysinki wykorzystuje się trypsinizację, która polega na potraktowaniu komórek „w tym przypadku, komórek nerkowych małpy” enzymem trypsyny, rozbijając jakiekolwiek skupisko komórek, które mogłoby się utworzyć, co powoduje utworzenie zawiesiny z pojedynczymi komórkami.

Trypsinizacjapasażowanie komórek przylegających nazywane tak gdyż stosuje się w tym celu enzym trypsynę – która trawi białka błony komórkowej, którymi przyczepiają się one do ścianek naczynia dzięki czemu komórki przechodzą do zawiesiny.

W początkowych badaniach nad wirusem polio hodowle tkanek prowadzono zazwyczaj przy zastosowaniu małpich nerek (lub czasem badano małpę). Dulbecco i Vogt objaśnili skąd pochodzi „wirus”, którego hodowali:

„Wirus został dostarczony w postaci 20% zawiesiny z tkanki rdzenia kręgowego małpy rezusa w  wodzie destylowanej. Typ 1 wirusa został pozyskany poprzez przepuszczenie go przez monowarstwę kultury komórek nerkowych. Typ 2, szczep Yale-SK oraz typ 3, szczep Leon, zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr. J.L. Melnicka w formie nadsącza kultury tkankowej.”9

Ten fragment tekstu wyraźnie wykazuje, że Dulbecco i Vogt bynajmniej nie wyizolowali czystego wirusa polio w żadnym ze swych eksperymentów opisanych w publikacji z 1954 roku. Kiedy opisywali, że obsiewają swoje kultury komórkowe „wirusem” to w rzeczywistości używali do tego nieoczyszczonej zawiesiny, a nie czystego wyizolowanego wirusa.

Gdy małpie nerki zostały zmielone na „pojedyncze komórki, skupiska komórek i resztki komórek” to zostały obsiane emulsją z małpiego rdzenia kręgowego. Zmieniający się wygląd łysinek był dowodem na to, że wirus mnoży się – zgodnie z modelem, który Dulbecco opracował w 1952 roku.8

Badanie kontrolne dla tych eksperymentów polegało na potraktowaniu kultur małpią antysurowicą (pochodzącą od małp zainfekowanych wirusem polio typu 1, 2 lub 3). Jeśli antysurowica Typu 1 hamowała tworzenie się łysinki, zaś antysurowica Typu 2 lub 3 (lub normalna małpa) tego nie robiła, to zakładano w tej kulturze wyłączną obecność wirusa polio Typu 1. Innymi słowy zakładano, że żaden inny organizm, ani inny czynnik chorobotwórczy nie rozwijał się w tej hodowli.

Po raz kolejny, to co Dulbecco i Vogt opisują jako „izolowanie” wirusa polio nie jest wyizolowaniem w sposób jaki rozumiemy to wg współczesnej mikrobiologii. By przeprowadzić ich „oczyszczanie łysinki”, po prostu pipetowali trochę płynu („bulion łysinek [plaque stock]”) z jednej szalki kultur i ponownie pokrywali nim inne szalki hodowlane. Gdy hodowle komórek drugiej generacji wykazywały dowód na wzrost wirusa (tj. zmieniony obraz łysinki) to inokulowano małpy zawartością bulionu łysinek. U inokulowanych małp rozwijało się porażenie, a w końcu większa część z nich zmarła.

Ponieważ łysinka z oczyszczonym bulionem wirusowym zarówno przyczyniła się do powstania drugiej generacji kultur komórkowych jak i powodowała u małp rozwój porażenia wiotkiego, to Dulbecco i Vogt wywnioskowali, że „wyizolowali” wirusa polio.

Podobnie jak badacze wirusa polio przed nimi, Dulbecco i Vogt rozmnażali substancje związane z chorobą w swoich kulturach komórkowych, a później wprowadzali te substancje do organizmów małp u których następnie rozwijało się porażenie. To było imponujące osiągniecie.

Jednak twierdzenie Dulbecco i Vogt wybiega znacznie poza dowody, jakimi dysponowali na ich poparcie. Twierdzili oni nie tylko iż wyizolowali wirusa polio, ale że „każda łysinka bulionu pochodzi z pojedynczej cząsteczki wirusa (jak dowodzili w dyskusji), a te zasoby stanowią najczystszą postać wirusa jaka może być obecnie dostępna”.

Skąd oni mogliby wiedzieć, że „pojedyncza cząsteczka wirusa”, coś czego oni nigdy nie widzieli ani nie zmierzyli jest przyczyną wzrostu jednej łysinki w ich hodowlach komórkowych?

Dowód jaki Dulbecco i Vogt dostarczają na „udowodnienie” twierdzenia, że pojedyncza cząsteczka wirusa tworzy każdą łysinkę, zawarty jest w matematycznym równaniu: Ekstrapolowali kultury komórkowe, rzekomy „stężony wirus” z liczby rozcieńczeń pierwotnego płynu (np. zawiesiny z rdzenia kręgowego małpy). Im mniej razy płyn został rozcieńczony tym więcej łysinek powstawało w hodowli laboratoryjnej; im bardziej został rozcieńczony tym mniej łysinek powstawało. Matematyczny model Dulbecco i Vogt zakładał ten linearny związek pomiędzy rozcieńczeniem zasobów wirusa i liczbą powstałych łysinek, a kiedy doszli do największego możliwego rozcieńczenia, które wciąż powodowało wzrost pojedynczej łysinki to zakładali, że tylko jedna „cząsteczka wirusa” była tam obecna. Jak udowadniali założenie co do którego zaręczali? Poprzez ich matematyczny model. Jest to doskonały dowód tautologiczny. Jego najbardziej oczywistą wadą było to, że ów matematyczny model „nie mógł” rozróżnić „pojedynczej cząsteczki wirusa” i kompleksu biologicznego, który mógł zawierać jeden wirus.

Jest to wyraźnie widoczne w opisie Dulbecco i Vogt o formowaniu się łysinki „pojedynczej cząsteczki wirusa” co do której twierdzili, że została wyizolowana:

„Po dotarciu do tego punktu możliwym stało się dokładne określenie charakterystyki cząsteczki wirusa wykrytej dzięki łysince. Ze względu na jej całkowite lub żadne oddziaływanie ma charakter pojedynczej cząsteczki. Odpowiada to jednostce wirusa, który nie podlega dalszemu podziałowi w jeszcze wyższym rozcieńczeniu.”

Dzięki właściwościom przez które jest rozpoznawany, możemy nazwać to cząsteczką formującą łysinkę. Nie znamy jego właściwości morfologicznych ani genetycznych. To może być pojedynczy podstawowy organizm lub ich zbitka, pod warunkiem, że owa zbitka utrzymuje się w nieskończoność przy wysokim rozcieńczeniu…9

Z perspektywy czasowej zaskakuje fakt, że Dulbecco i Vogt wspomnieli o możliwości wykrycia „zbitki” materiału, a potem zignorowali ten fakt. Co jeśli inny typ wirusa również był zawarty w tych cząsteczkach? Albo co w sytuacji gdy genetyczny materiał gospodarza przyłączył się do owej cząsteczki formując tą „zbitkę”?

Choć mikroskop elektronowy „który pozwoliłyby im zwizualizować pojedynczą cząsteczkę wirusa” istniał w 1954 roku, to Dulbecco i Vogt nie użyli go. Zamiast tego posłużyli się uznaną technologią w której zakłada się, że wirusy są obecne w ich kulturach, jeśli pewne substancje chemiczne je zabarwią lub płyny o których się myśli, że je zawierają, wytworzą charakterystyczny wzorzec wzrostu, jak owe opisane tu łysinki związane z wirusem polio. Dulbecco i Vogt nie mogli w żaden sposób określić, że oglądają pojedyncze wirusy w swoich hodowlach więc założenie, że wyizolowali „pojedynczą cząsteczkę wirusa” było ogromną przesadą. Tak więc Dulbecco i Vogt nie wyizolowali wirusa polio.

Źródło: Will The Poliovirus Eradication Program Rid the World of Childhood Paralysis?

 

 

Przypisy:

1.      Abate, Tom. February 11, 2001. Genome discovery shocks scientists. San Francisco Chronicle.

2.      Betarbet, R., T.B. Sherer, G. MacKenzie, M. Garcia-Osuna, A.V. Panov, and J.T. Greenamyre. December 2000. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nature Neuroscience 3(12):1301.

3.      Brown, David. January 1, 2001. Ready to let go of polio? Mutant virus in Caribbean outbreak alarms health experts.Washington Post, p. A7.

4.      Burnet, F.M. and J. MacNamara. 1931. Immunological differences between strains of poliomyelitic virus. The British Journal of Experimental Pathology 12(2):5.

5.      Chaves, S.S., S. Lobo, M. Kennett, and J. Black. February 24, 2001. Coxsackie virus A24 infection presenting as acute flaccid paralysis. The Lancet 357:605.

6.      Dalldorf, G. and G.M. Sickles. 1948. An unidentified, filtrable agent isolated from the feces of children with paralysis.Science 108:61.

7.      Davis, W.M. 1919. The demonstration of immune opsonins for the pleomorphic streptococcus in the experimental poliomyelitis in monkeys. Journal of Infectious Diseases 24:176.

8.      Dulbecco, R. 1952. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 38:747.

9.      Dulbecco, R. and M. Vogt. 1954. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J. Exp. Med.99:167-182.

10.     Eggers, H.J. 1999. Milestones in early poliomyelitis research (1840-1949). Journal of Virology 73(3):4533.

11.     Enders, J.F. 1954. Some recent advances in the study of poliomyelitis. Talk given on the occasion of receiving the Passano Award, June 3, 1953. Published in Medicine 33:87, May 1954.

12.     Enders, J.F. 1972. Early observations on cytopathogenicity of poliovirus. American Journal of Clinical Pathology    57(6):846.

13.     Enders, J.F., T.H. Weller, and F.C. Robbins. 1949. Cultivation of the Lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science 109:85.

14.     Flexner, S. and P.A. Lewis. 1909. The transmission of acute poliomyelitis to monkeys. Journal of the American Medical Association 53:1639.

15.     Gordon, F.B., F.M. Schabel, Jr., A.E. Casey, and W.I. Fishbein. 1948. Laboratory study of the epidemiology of poliomyelitis. Journal of Infectious Diseases 82:294.

16.     Hart, D.E. et al. 1994. Childhood Guilliain-Barré Syndrome in Paraguay, 1990 to 1991. Annals of Neurology 36(6):859.

17.     Hassan, Abdalla. February 22, 2001. Egypt appears close to wiping out polio scourge. Reuters News Service.

18.     International Human Genome Sequencing Consortium. February 15, 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409:860.

19.     Joklik, W.K. When two is better than one: Thoughts on three decades of interaction between Virology and the Journal of Virology. 1999. Journal of Virology 73(5):3520.

20.     Landsteiner, K. and E. Popper. 1909. Uebertragung der poliomyelitis acuta auf affen. Z. Immunitatsforsch 2:377.

21.     Melnick, J.L. and R. Ward. 1945. Susceptibility of vervet monkeys to poliomyelitis virus in flies collected at epidemics.Journal of Infectious Diseases 77:251.

22.     Melnick, J.I. and N. Ledinko. 1952. Vaccination as a provoking factor in poliomyelitis: An experimental approach. Journal of Infectious Diseases 90:279.

23.     Merck Manual, Fifteenth Edition. 1987. Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.

24.     Morbidity and Mortality Weekly Report. May 19, 2000. Poliomyelitis prevention in the United States: Updated Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). U.S. Department of Health & Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333.

25.     Morbidity and Mortality Weekly Report. December 8, 2000. Outbreak of poliomyelitis, Dominican Republic and Haiti, 2000. U.S. Department of Health & Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333.

26.     Morbidity and Mortality Weekly Report. January 26, 2001. Circulation of a Type 2 vaccine-derived poliovirus. Egypt, 1982-1993. U.S. Department of Health & Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333.

27.     Morbidity and Mortality Weekly Report. March 2, 2001. Outbreak of poliomyelitis, Dominican Republic and Haiti, 2000- 2001. U.S. Department of Health & Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333.

28.     Morbidity and Mortality Weekly Report. March 2, 2001. Progress toward poliomyelitis eradication, Afghanistan, 1999- 2000. U.S. Department of Health & Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333.

29.     Morales, E.G. 1930. Acute anterior poliomyelitis at Vega Baja, Porto Rico. Journal of Infectious Diseases 46:32.

30.     Schabel, F.M., Jr., H.T. Smith, W.I. Fishbein, and A.E. Casey. 1950. Stool virus recovery in subclinical poliomyelitis during  incubation, febrile, and convalescent periods. Journal of Infectious Diseases 82:294.

31.     Strebel, P.M., R.W. Sutter, S.L. Cochi, et al. 1992. Epidemiology of poliomyelitis in the United States one decade after the  last reported case of indigenous wild virus-associated disease. Clin. Infect. Dis. 14:568.

32.     Venter, J.C., et al. February 16, 2001. The sequence of the human genome. Science 291:1304.

33.     Wenner, H.A., R.W. Menges, and G.S. Harshfield. 1954. Sporadic bovine encephalomyelitis: 3. Reproduction of the   disease, with particular reference to the role of poliomyelitis viruses in experimental infection in calves. Journal of Infectious Diseases 94:284.

 

Zobacz na: Historia poliomyelitis – dr Suzanne Humphries
Polio w USA w kontekście środowiskowym – DDT i substancje podobne do DDT
Związek pestycydów z polio: Krytyka literatury naukowej – Jim West
SV40 – rakotwórczy wirus w szczepionkach przeciw polio!
Ameby w szczepionkach przeciw polio
Raport Klennera czyli czego (prawie) nikt nie wie o witaminie C
Szczepionka polio spowodowała 47,500 przypadków paraliżu u hinduskich dzieci w 2011 roku
Mało znane fakty o szczepieniach przeciwko Heinego-Medina – Dr Viera Scheibner
Choroba Heinego-Medina – 2 przypadki na Ukrainie – wrzesień 2015

Program eradykacji wirusa polio

%d bloggers like this: